本文關(guān)鍵詞：基于雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)建立miR-140生物傳感器

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【摘要】：目的:利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)構(gòu)建可檢測miR-140活性的生物傳感器。方法:首先,在psiCHECK-2雙熒光報(bào)告基因質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)插入miR-140成熟體的4個拷貝反義序列,構(gòu)建miR-140sensor。其次,將miR-140 sensor和miR-140 mimics共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞,利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢驗(yàn)miR-140 sensor的功能。最后,轉(zhuǎn)染miR-140 sensor至大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat MSCs),分析在成軟骨誘導(dǎo)中miR-140的活性變化,并與miR-140的表達(dá)水平相比較。結(jié)果:在HEK-293T細(xì)胞中,相對于陰性對照組,miR-140 sensor與miR-140 mimics共轉(zhuǎn)能明顯降低49%(20 nmol·L-1)和65%(50 nmol·L-1)的熒光活性。將轉(zhuǎn)染miR-140 sensor的rat MSCs成軟骨誘導(dǎo)7 d后,熒光活性降低43%,提示miR-140活性升高,與RT-qPCR法檢測的miR-140表達(dá)水平相一致。結(jié)論:構(gòu)建的miR-140 sensor是一種簡單方便有效的miRNA傳感器,可用于檢測miR-140活性。
【作者單位】： 南京醫(yī)科大學(xué)附屬友誼整形外科醫(yī)院科教辦;南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子細(xì)胞生物學(xué)研究所;南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院整形外科;
【關(guān)鍵詞】： miR-生物傳感器 熒光素酶 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 成軟骨誘導(dǎo)
【基金】：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81071480)
【分類號】：R346
【正文快照】： 成熟的microRNAs(miRNAs)是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA(約22 nt),通過完全或部分互補(bǔ)結(jié)合靶mRNAs的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)負(fù)調(diào)控靶基因表達(dá)[1-2]。miRNAs具有組織特異性及發(fā)育時序性[3],與靶基因之間是多對多的關(guān)系,形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miRNAs的異常表達(dá)常常與疾病的

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本文編號：859133