本文關(guān)鍵詞：重組埃博拉VLP疫苗制備及免疫效果初步研究

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【摘要】：埃博拉病毒病(Ebola virus diseases,EVD)是由埃博拉病毒(Ebola virus)引起的一種高致病性的烈性傳染病。致病性最強的扎伊爾型埃博拉病毒(Zaire Ebola virus),致死率可高達(dá)90%。埃博拉疫情的爆發(fā)對人類產(chǎn)生極大的威脅,但目前仍沒有上市的埃博拉疫苗。病毒載體與埃博拉病毒保護性抗原GP蛋白重組的疫苗,如重組水泡口腔炎病毒(VSV)疫苗、重組腺病毒(r ADv3,r ADv5)疫苗等在靈長類動物中以誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答走在前面,而且已完成Ⅰ期臨床研究,有效解決了應(yīng)急需求,但它們均以活病毒為載體,存在潛在的安全性風(fēng)險,距離正式批準(zhǔn)上市仍有一段路要走。病毒樣顆粒疫苗(Virus-like particles,VLP)是一類具有病毒結(jié)構(gòu),沒有病毒復(fù)制能力,較減毒疫苗和以病毒為載體的疫苗更加安全的疫苗種類。以病毒樣顆粒形成的疫苗抗原可有效激發(fā)免疫應(yīng)答和免疫保護效果,研發(fā)病毒樣顆粒疫苗已成為埃博拉疫苗發(fā)展的重要方向。埃博拉病毒已被列為生物安全等級4級的病毒,應(yīng)用埃博拉病原體的操作受到嚴(yán)格的限制和規(guī)定。因此阻礙了疫苗研發(fā)及其致病機制研究。而近年發(fā)展起來的假病毒系統(tǒng)可以模擬埃博拉病毒感染宿主過程,無病毒的致病性,可在中和抗體等多方面替代病毒的使用,在低安全級別的實驗室進行操作,為埃博拉疫苗有效性評價提供了保證。目前處于Ⅰ期臨床階段的埃博拉疫苗與現(xiàn)上市疫苗一樣,多為有針肌肉注射免疫,存在恐針感、交叉感染、斷針等弊端,抗原用量大、免疫保護不全面現(xiàn)實問題。由此,在免疫接種策略上降低抗原用量、誘發(fā)全面免疫應(yīng)答與保護及無針無痛、簡便快速、安全高效已成為疫苗研發(fā)迫切解決的重大科學(xué)問題。隨著近年無針注射技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用,為發(fā)展無針皮內(nèi)免疫埃博拉疫苗提供了新思路。本研究針對目前流行的扎伊爾型埃博拉病毒疫苗研發(fā)的現(xiàn)實需求,采用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)制備ZEBOLA-VLP,通過無針皮內(nèi)、有針肌肉注射途徑分別免疫BALB/c小鼠,并制備重組扎伊爾型埃博拉假病毒用于中和抗體測定,其研究簡要報告如下:一、目的運用Bac-to-Bac昆蟲表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)扎伊爾型埃博拉病毒GP+VP40-VLP(ZEBOLA-VLP)疫苗,經(jīng)皮內(nèi)、肌肉途徑分別免疫小鼠,并以HIV骨架構(gòu)建扎伊爾型埃博拉病毒囊膜GP蛋白的假病毒,評價免疫效果,為研發(fā)ZEBOLA-VLP疫苗提供實驗依據(jù)。二、方法1、重組ZEBOLA-VLP抗原制備:首先通過Vector NTI AdvanceⅡ系統(tǒng)對扎伊爾型埃博拉病毒保護性抗原GP和VP40蛋白基因序列進行優(yōu)化;采用基因重組構(gòu)建穿梭質(zhì)粒p Fast Bac DUAL-VP40-GP;將重組的ZBacmid-VP40-GP轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細(xì)胞獲取重組桿粒病毒,表達(dá)重組ZEBOLA-VLP抗原;進一步超濾濃縮,蔗糖梯度離心純化制備ZEBOLA-VLP抗原;通過SDS-PAGE、Western blot和HPLC等方法對重組ZEBOLA-VLP抗原鑒定。2、重組埃博拉假病毒系統(tǒng)構(gòu)建:以埃博拉病毒GP基因為靶點,采用慢病毒骨架,合成埃博拉病毒表面囊膜結(jié)構(gòu)基因;借助輔助載體等表達(dá)埃博拉病毒的糖蛋白GP;與HIV骨架包被,制備只能感染細(xì)胞和安全性良好的假病毒系統(tǒng)。為埃博拉疫苗評價提供實驗基礎(chǔ)。3、重組ZEBOLA-VLP抗原免疫效果初步評價:取制備的重組ZEBOLA-VLP抗原1μg、3μg、10μg、30μg、50μg劑量組分別無針皮內(nèi)和有針肌肉免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠,間隔21日加強免疫一次,并用等量的PBS作陰性對照,于免疫前、免疫后14日采血;采用重組扎伊爾型埃博拉假病毒及間接ELISA方法分別測定免疫小鼠血清中和抗體效價和特異性Ig G抗體效價,評價重組ZEBOLA-VLP疫苗的免疫效果。三、結(jié)果成功構(gòu)建扎伊爾型埃博拉p Fast Bac DUAL-VP40-GP穿梭質(zhì)粒并在昆蟲細(xì)胞中獲得高效表達(dá),經(jīng)30%和60%蔗糖梯度離心加S600柱層析獲得了95%純度的重組ZEBOLA-VLP候選疫苗抗原。制備的ZEBOLA-VLP抗原經(jīng)SDS-PAGE、Western blot鑒定有目的蛋白,電鏡下觀察病毒顆粒結(jié)構(gòu)大小均一,HLPC測定重組ZEBOLA-VLP抗原純度達(dá)到95%;經(jīng)顯微觀察及假病毒滴定判定,成功包裝了穩(wěn)定性好、滴度高、安全的假病毒系統(tǒng),可用于中和抗體效價檢測;免疫重組ZEBOLA-VLP疫苗各劑量組均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生中和抗體,并存在劑量依賴關(guān)系;無針皮內(nèi)免疫小鼠10μg為注射最佳劑量,其刺激產(chǎn)生的特異性Ig G抗體效價明顯高于其他劑量組;相同劑量組比較,無針皮內(nèi)免疫效果均高于肌肉注射組。四、結(jié)論1、率先在國內(nèi)針對當(dāng)前爆發(fā)的扎伊爾型埃博拉流行株成功研制出高純度重組ZEBOLA-GP+VP40 VLP疫苗,為防控埃博拉提供了新疫苗類型;2、借助HIV慢病毒并針對扎伊爾型埃博拉流行株成功制備出高滴度、穩(wěn)定性好、安全性高的重組埃博拉假病毒,為研發(fā)埃博拉疫苗的有效性評價提供了實驗材料。3、創(chuàng)新研發(fā)的低壓無針免疫重組ZEBOLA GP+VP40-VLP疫苗具有良好的免疫效應(yīng)和安全性,且疫苗抗原用量比有針肌肉注射免疫用量少,此埃博拉疫苗類型填補了這一領(lǐng)域的國內(nèi)外空白。
【關(guān)鍵詞】：埃博拉病毒 Bac-to-Bac昆蟲表達(dá)系統(tǒng) 病毒樣顆粒 疫苗 免疫效果
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 縮略詞表10-13
• 前言13-17
• 第一部分 重組ZEBOLA VLP疫苗制備與鑒定17-41
• 1、實驗材料17-20
• 2、實驗方法20-32
• 3、結(jié)果32-37
• 4、討論37-41
• 第二部分 重組埃博拉假病毒制備與鑒定41-52
• 1、實驗材料41-43
• 2、實驗方法43-48
• 3、結(jié)果48-50
• 4、討論50-52
• 第三部分 重組ZEBOLA-VLP疫苗在小鼠體內(nèi)免疫效果評價52-64
• 1、實驗材料52-54
• 2、實驗方法54-58
• 3、結(jié)果58-62
• 4、討論62-64
• 結(jié)論64-66
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 綜述72-82
• 綜述參考文獻(xiàn)78-82
• 致謝82-84
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄84

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1 任天宇;重組埃博拉VLP疫苗制備及免疫效果初步研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2015年

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本文編號：838918