本文關鍵詞：不可分型流感嗜血桿菌F蛋白與脂蛋白（a）的相互作用

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【摘要】：F蛋白(Protein F, PF)是不可分型流感嗜血桿菌(nontypeable Haemophilus influenzae, NTHi)表面的一種纖溶酶原(Plasminogen, Plg)受體。Pig利用自身的賴氨酸結(jié)合位點(LBS)與PF相結(jié)合。脂蛋白(a)[lipoprotein(a), Lp(a)]中的載脂蛋白[apolipoprotein(a), Apo(a)]與Pig高度同源,其KIV10結(jié)構(gòu)域含有高親和力的LBS�；诖�,本實驗提出Lp(a)可能與NTHi上的PF相結(jié)合,從而競爭性的抑制PF與Pig的結(jié)合。本實驗利用多種方法檢測了重組PF (rPF)以及缺失末端賴氨酸殘基的PFAk (rPF△k)與Pig、Lp(a)的相互作用。首先利用大腸桿菌BL21誘導表達得到了rPF及rPF△k,并利用親和填料進行了純化。然后通過ELISA結(jié)合及抑制試驗檢測了rPF及rPF△k與Pig、Lp(a)的相互作用。結(jié)合試驗結(jié)果顯示：rPF能夠與Pig、Lp(a)結(jié)合,且rPF組與Pig、Lp(a)的結(jié)合值顯著高于rPF△k組。抑制試驗結(jié)果如下：1)EACA能夠抑制rPF與Pig、Lp(a)的結(jié)合,當濃度達到2 mmol/L時EACA對rPF與Pig結(jié)合的抑制作用顯著增強。與此同時,ECAC對rPF與Lp(a)結(jié)合的抑制作用在其濃度為0.2 mmol/L時就明顯增強；2)當Lp(1a)濃度達到50 ng/100gL時,能夠顯著的抑制rPF與Pig的結(jié)合。此外,本實驗利用親和層析和Western blot也證明了rPF與Pig、Lp(a)的特異性結(jié)合主要是由Pig、Lp(a)的LBS與rPF羧基末端的賴氨酸殘基相互作用形成的。Lp(a)能夠競爭性的抑制rPF與Pig的結(jié)合,這表明Lp(a)在抗NTHi感染過程中可能具有一定的作用。
【關鍵詞】：不可分型流感嗜血桿菌 纖溶酶原 脂蛋白(a) F蛋白
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要3-4
• abstract4-8
• 縮略語表8-9
• 1 引言9-16
• 1.1 流感嗜血桿菌及其表面的纖溶酶原受體9-10
• 1.2 Plg-Pm系統(tǒng)10-13
• 1.2.1 Plg、Pm的組成及構(gòu)象10-11
• 1.2.2 Plg、Pm的功能11
• 1.2.3 PA簡介11-12
• 1.2.4 纖溶酶原激活劑抑制劑(Plasminogen activate inhibitors,PAIs)12-13
• 1.2.5 Pm抑制劑13
• 1.3 人血漿Lp(a)13-15
• 1.3.1 Lp(a)的結(jié)構(gòu)13-14
• 1.3.2 Lp(a)的功能作用14-15
• 1.4 立題依據(jù)15
• 1.5 研究內(nèi)容15-16
• 2 材料與方法16-27
• 2.1 實驗材料16-18
• 2.1.1 儀器設備16
• 2.1.2 化學試劑16-17
• 2.1.3 質(zhì)粒和菌株17
• 2.1.4 培養(yǎng)基17
• 2.1.5 化學貯存液17-18
• 2.1.6 PCR引物18
• 2.2 實驗方法18-27
• 2.2.1 NTHi ATCC49247基因組DNA的提取及鑒定18
• 2.2.2 NTHi表面hpf、hpf△k基因的擴增18-19
• 2.2.3 pGEX-6p-1質(zhì)粒的提取19
• 2.2.4 載體及片段的酶切、純化及連接轉(zhuǎn)化19-21
• 2.2.5 陽性菌篩選21-22
• 2.2.6 陽性菌落的擴大培養(yǎng)及菌種保存22
• 2.2.7 基因序列的測定22
• 2.2.8 工程菌的培養(yǎng)及誘導表達22-23
• 2.2.9 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析23
• 2.2.10 重組蛋白rPF、rPF△k的純化23-24
• 2.2.11 目的蛋白標簽的切除24
• 2.2.12 標簽切除效果的Western-blot檢測24-25
• 2.2.13 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測rPF、rPF△k與Plg、Lp(a)的結(jié)合25-26
• 2.2.14 ELISA檢測EACA對rPF與Plg、Lp(a)結(jié)合的抑制26-27
• 3 結(jié)果27-36
• 3.1 NTHi ATCC49247基因組的提取27
• 3.2 目的基因的擴增27-28
• 3.2.1 hpf基因的擴增27-28
• 3.2.2 hpf△k擴增結(jié)果28
• 3.3 質(zhì)粒的提取28
• 3.4 質(zhì)粒及目的片段酶切結(jié)果28-29
• 3.5 菌落PCR結(jié)果29
• 3.6 工程菌表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析29-31
• 3.6.1 rPF小量表達結(jié)果29-30
• 3.6.2 rPF△k小量表達結(jié)果30-31
• 3.7 重組蛋白的純化31-32
• 3.7.1 rPF純化結(jié)果31
• 3.7.2 rPF△K純化結(jié)果31-32
• 3.8 目的蛋白標簽的切除及純化32-33
• 3.8.1 rPF標簽的切除32
• 3.8.2 rPF△K標簽的切除32-33
• 3.9 標簽切除效果的Western blot檢測33
• 3.10 ELISA檢測rPF、rPF△k與Plg、Lp(a)的結(jié)合33-34
• 3.11 親和色譜層析檢測rPF、rPF△k與Lp(a)的結(jié)合34
• 3.12 ELISA檢測EACA對rPF與Plg、Lp(a)結(jié)合的抑制34-35
• 3.13 ELISA檢測Lp(a)對rPF與Pig結(jié)合的抑制35-36
• 4 討論36-37
• 5 結(jié)論37-38
• 致謝38-39
• 參考文獻39-45
• 作者簡介45

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