發(fā)布時間：2017-08-28 12:33

  本文關鍵詞：CR1SPR-Cas9技術構建LCA-Nmnat1小鼠動物模型及其發(fā)病機理研究和PHEX基因新發(fā)嵌合突變導致低磷酸鹽血癥性佝僂病

  更多相關文章： 先天性黑蒙癥 MMNAT1基因 CRISPR-Cas9技術 小鼠動物模型 X連鎖顯性低磷酸鹽血癥性佝僂病 PHEX基因 嵌合突變

【摘要】：第一部分CRISPR-Cas9技術構建LCA-Nmnatl小鼠動物模型及其發(fā)病機理研究背景：遺傳性疾病是出生缺陷的重要原因,單純性眼科遺傳病近300種,其中先天性黑蒙癥(Leber's congenital amaurosis, LCA)是發(fā)生最早、最嚴重的遺傳性視網(wǎng)膜病變。目前已發(fā)現(xiàn)18種與LCA相關的致病基因,我們課題組運用外顯子組捕獲和新一代高通量測序的方法,發(fā)現(xiàn)NMNAT1基因突變可以導致第9型先天性黑蒙癥。但是具體的突變致病機制未知。方法：從生物信息學分析、細胞學分析以及CRISPR-Cas9構建定點突變小鼠動物模型三方面探究突變可能的致病機理。生物信息學分析包括人和小鼠NMNAT1蛋白同源性分析,確保以小鼠作為動物模型的可信性；蛋白晶體結(jié)構分析,找到最可能影響蛋白結(jié)構的位點作為突變研究對象；蛋白質(zhì)相互作用分析,探索與NMNAT1相互作用的蛋白。細胞學分析方面構建8種突變和一種野生型重組質(zhì)粒,進行熒光共聚焦和熒光定量實驗,探究突變對亞細胞定位和對RNA水平的影響,后續(xù)將進一步進行蛋白質(zhì)水平的Western Blot實驗。CRISPR-Cas9構建小鼠動物模型方面,已獲得用于顯微注射的gRNA、Cas9 mRNA和模板DNA,已購買和飼養(yǎng)供體鼠(C57)和受體鼠(ICR),獲得動物模型后將從表型、生化分析、細胞分子水平等方面全面探索致病機制,并且探尋可行的治療方法。結(jié)果：人和小鼠NMNAT1蛋白質(zhì)高度同源。蛋白晶體結(jié)構分析纈氨酸151(V151)位于蛋白的疏水核心,纈氨酸98(V98)接近配體結(jié)合位點,Trp85* (M255)以及Trp169* (M507)無義突變蛋白明顯截短,結(jié)構分散。蛋白質(zhì)相互作用預測其與多種蛋白存在可能的相互作用。熒光共聚焦實驗結(jié)果顯示Trp85*亞細胞定位有明顯逸散出細胞核的現(xiàn)象,其他突變亞細胞定位無異常。熒光定量實驗顯示Trp85*(M255)、Trp169* (M507)無義突變體以及Met35Thr (M104)、Leu153Val(M457)錯義突變體RNA水平和野生型差別不大,而Val151Phe(M451)錯義突變體RNA水平顯著下降。CRISPR-Cas9構建小鼠動物模型方面,已經(jīng)準備好注射用的RNA和模板DNA。結(jié)論：本研究擬從生物信息學、細胞生物學、分子生物學、生物化學、組織和器官等多角度闡明NMNAT1突變和先天性黑蒙癥的關系。目前進展順利,已完成前期工作,包括生物信息學分析,細胞生物學的部分分析和CRISPR-Cas9構建小鼠動物模型前面部分,后續(xù)將進一步探究突變的致病機制,以及利用藥物治療和基因治療手段研究治療先天性黑蒙癥的可行性,為臨床研究和治療奠定理論基礎。第二部分PHEX基因新發(fā)嵌合突變導致低磷酸鹽血癥性佝僂病X連鎖顯性低磷酸鹽血癥性佝僂病(MIM#307800),是一種遺傳性骨病。主要表現(xiàn)為腎小管對磷酸鹽的重吸收異常、發(fā)育遲緩、身材矮小、骨骼疼痛、牙釉質(zhì)異常、雙下肢畸形、行走無力,X射線提示佝僂病癥狀。該病是由位于X染色體p22.1-22.2上PHEX基因突變造成。在本研究中,我們診斷出一個患病男孩,其PHEX基因看似雜合,我們擬探尋具體的致病機制。雖然患者是一名男孩,Sanger測序顯示其X染色體上的PHEX基因有表象上雜合突變,存在雙峰,一個是正常的堿基“G”,另一個是“A”。TA克隆測序表明確實存在這兩種堿基,并且獲得了大致的比率。之后我們用生物信息學工具預測以及外顯子捕獲技術實驗驗證該剪切位點突變對RNA剪切的影響。熒光定量PCR實驗用以檢測PHEx的基因拷貝數(shù)。TA克隆測序?qū)嶒烇@示正常堿基G和突變堿基A的頻率比為19：13。染色體核型分析結(jié)果顯示病人核型正常,熒光定量PCR檢測基因拷貝數(shù)的結(jié)果驗證了核型分析的結(jié)果。這個剪切突變將會引起外顯子18中4個堿基丟失,造成移碼突變,蛋白截短,PHEX蛋白的激活位點和Zn2+結(jié)合位點喪失,因此造成腎小管重吸收障礙和骨骼礦化異常。總之,發(fā)生在保守剪切位點的突變將會造成異常的剪切,形成功能受損的蛋白。我們發(fā)現(xiàn)的新發(fā)突變是一個嵌合突變,可能發(fā)生于前期受精卵階段。本研究對于之后進行X連鎖顯性低磷酸鹽血癥性佝僂病的遺傳咨詢時考慮嵌合突變起到重要的提示作用。
【關鍵詞】：先天性黑蒙癥 MMNAT1基因 CRISPR-Cas9技術 小鼠動物模型 X連鎖顯性低磷酸鹽血癥性佝僂病 PHEX基因 嵌合突變
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R-332;R774.1
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-13
• 第一部分 CRISPR-Cas9技術構建LCA-Nmnat1小鼠動物模型及其發(fā)病機理研究13-63
• 1 引言13-16
• 2 材料和方法16-44
• 3 結(jié)果44-57
• 4 討論與小結(jié)57-60
• 5 參考文獻60-63
• 第二部分 PHEX基因新發(fā)嵌合突變導致低磷酸鹽血癥性佝僂病63-97
• 1 引言63-64
• 2 材料和方法64-84
• 3 結(jié)果84-91
• 4 討論91-93
• 5 小結(jié)93-94
• 6 參考文獻94-97
• 綜述97-104
• 參考文獻101-104
• 作者簡介及在讀期間所取得的科研成果104-105

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 徐遠達,蕭正倫,羅煒,黃海鷺;新建一種早期急性呼吸窘迫綜合征的動物模型[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2000年03期

2 富琦,陳信義;建立病證結(jié)合動物模型的新思路[J];中國中醫(yī)藥信息雜志;2003年09期

3 董曉華,張丹參,武海霞;衰老動物模型的研究進展及評價[J];河北北方學院學報;2004年06期

4 彭鵬,杜秀平;肺癌動物模型的制作概況[J];徐州醫(yī)學院學報;2005年03期

5 彭炳蔚,任連坤,吳立文;癲沲動物模型的研究進展[J];中華神經(jīng)科雜志;2005年10期

6 焦東亮;倪秀石;;短暫性腦缺血發(fā)作的動物模型[J];國外醫(yī)學(腦血管疾病分冊);2005年10期

7 王斌;武漢;劉恒;;股骨頭缺血性壞死動物模型在中醫(yī)科研中的應用[J];長春中醫(yī)學院學報;2005年04期

8 李才銳,姜德詠;糖尿病視網(wǎng)膜病變動物模型[J];國外醫(yī)學.眼科學分冊;2005年01期

9 劉穩(wěn);高志強;;周圍性面神經(jīng)麻痹的動物模型[J];國際耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2006年02期

10 焦劍;劉武;;實驗性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變動物模型的建立[J];國際眼科雜志;2006年05期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 白躍宏;沈曉艷;曹曼林;;慢性骨筋膜室綜合征動物模型的建立及實驗研究[A];中華醫(yī)學會疼痛學分會第七屆年會論文摘要集[C];2007年

2 曹敬麗;黃紅云;;癡呆動物模型[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第四屆全國代表大會論文匯編[C];2009年

3 魏瑋;;證候動物模型述評[A];中醫(yī)藥中青年科技創(chuàng)新與成果展示論壇論文集[C];2009年

4 崔軼凡;王慶國;;病證結(jié)合動物模型對中醫(yī)藥研究的意義及建模方法新思路[A];仲景醫(yī)學求真（續(xù)三）[C];2009年

5 魏瑋;;證候動物模型述評[A];自主創(chuàng)新與持續(xù)增長第十一屆中國科協(xié)年會論文集（3）[C];2009年

6 徐國會;勵建安;王彤;周士枋;;慢性冠狀動脈狹窄及側(cè)枝循環(huán)的動物模型[A];中國康復醫(yī)學會第四屆會員代表大會暨第三屆中國康復醫(yī)學學術大會論文匯編[C];2001年

7 胡連生;李忠卓;劉海軍;張鐵民;;肝火上擾型耳聾動物模型的實驗初探[A];中國中西醫(yī)結(jié)合學會成立20周年紀念大會論文集[C];2001年

8 苗明三;方曉艷;孫艷紅;;氣血雙虛動物模型的復制[A];首屆中國中醫(yī)藥實驗動物科技交流會論文匯編[C];2002年

9 秦任甲;;高黏滯動物模型[A];中國生物醫(yī)學工程學會第六次會員代表大會暨學術會議論文摘要匯編[C];2004年

10 張如意;艾厚喜;葉翠飛;李林;;擬抽動動物模型的建立及評價[A];中國神經(jīng)科學學會第六屆學術會議暨學會成立十周年慶祝大會論文摘要匯編[C];2005年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 丁萍　丁香;“讓我代表動物懲罰你”[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2009年

2 吉林工程技術師范學院職業(yè)教育學院 王哲;試述心理學前瞻性記憶模型研究進展[N];吉林日報;2010年

3 張剛強;生物醫(yī)學和藥物研究動物模型規(guī)劃研討會召開[N];中國醫(yī)藥報;2010年

4 記者 衣曉峰 通訊員 吳丹;新血管內(nèi)膜增生動物模型研制成功[N];健康報;2013年

5 記者 譚欣;創(chuàng)新建立中醫(yī)證候動物模型[N];中國中醫(yī)藥報;2013年

6 裘 索;中醫(yī)藥現(xiàn)代化若干問題的思考[N];中國中醫(yī)藥報;2004年

7 新華社記者 毛磊;人應該學會與動物共存[N];新華每日電訊;2003年

8 趙琰 屈會化 王慶國;建立病證結(jié)合理想模型的新思路[N];中國醫(yī)藥報;2006年

9 李荔;牛昱宇：轉(zhuǎn)基因獼猴培育成功[N];北京科技報;2010年

10 本報記者 何世文;我們也是沒有硝煙戰(zhàn)場上的戰(zhàn)士[N];科技日報;2003年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王玉芝;玉屏銀屑方對濕熱證型銀屑病動物模型免疫調(diào)節(jié)作用的實驗研究[D];山東中醫(yī)藥大學;2013年

2 柴亮;自身免疫性內(nèi)耳病動物模型的建立和凋亡及其相關蛋白在實驗性自身免疫性內(nèi)耳病的表達[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2003年

3 朱峰;炎癥性腸病免疫動物模型的建立及其發(fā)病機制和藥物治療的探討[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;1997年

4 成俊;腰椎融合動物模型的建立及生物力學實驗研究[D];四川大學;2006年

5 隰建成;椎間盤源性下腰痛動物模型的建立及行為學觀察[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2006年

6 姜偉洲;基于中醫(yī)理論的肺陰虧虛、寒邪犯肺證動物模型的建立及相關理論的研究[D];山東中醫(yī)藥大學;2010年

7 徐冰;常見人體腫瘤轉(zhuǎn)移動物模型的建立及相關機理研究[D];南方醫(yī)科大學;2007年

8 袁靜;兩種微生態(tài)學動物模型的建立及其在抗菌藥物殘留安全評估中的應用研究[D];第三軍醫(yī)大學;2009年

9 郭淑貞;血瘀證（心肌缺血）動物模型及其相關蛋白質(zhì)組學研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2007年

10 林曉靜;過熱復合脂多糖致熱射病大鼠動物模型多器官急性損傷的實驗研究[D];南方醫(yī)科大學;2009年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 章敏貴;放射性淚腺損傷動物模型的建立、病理生理機制研究及Gadd45 α在其損傷修復中作用的探討[D];復旦大學;2014年

2 毛雅琴;幽門螺桿菌國內(nèi)流行株動物模型的建立[D];浙江大學;2015年

3 孫志文;病毒介導反義CK13基因?qū)θ吮茄拾〩NE1細胞動物模型放療敏感性的影響[D];昆明醫(yī)科大學;2015年

4 李帥杰;前列腺2μm激光切除術后尿道上皮修復機制研究的動物模型的建立[D];遵義醫(yī)學院;2016年

5 李金軒;一種新型脊髓壓迫動物模型的建立及自噬因子beclin1表達研究[D];山西醫(yī)科大學;2016年

6 袁育韜;胃癌原位種植淋巴轉(zhuǎn)移動物模型的建立[D];南京大學;2016年

7 崔丹;調(diào)節(jié)性T細胞在吉蘭—巴雷綜合征動物模型中免疫機制的研究[D];蚌埠醫(yī)學院;2016年

8 陳姣;CR1SPR-Cas9技術構建LCA-Nmnat1小鼠動物模型及其發(fā)病機理研究和PHEX基因新發(fā)嵌合突變導致低磷酸鹽血癥性佝僂病[D];浙江大學;2016年

9 于仁朝;大鼠異側(cè)頸總動脈端側(cè)吻合動物模型的制作及評價[D];蚌埠醫(yī)學院;2016年

10 張大偉;血栓閉塞性脈管炎動物模型的研制[D];山東中醫(yī)藥大學;2001年

，

本文編號：747925