本文關(guān)鍵詞：CR1SPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建LCA-Nmnat1小鼠動物模型及其發(fā)病機(jī)理研究和PHEX基因新發(fā)嵌合突變導(dǎo)致低磷酸鹽血癥性佝僂病

  更多相關(guān)文章： 先天性黑蒙癥 MMNAT1基因 CRISPR-Cas9技術(shù) 小鼠動物模型 X連鎖顯性低磷酸鹽血癥性佝僂病 PHEX基因 嵌合突變

【摘要】：第一部分CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建LCA-Nmnatl小鼠動物模型及其發(fā)病機(jī)理研究背景：遺傳性疾病是出生缺陷的重要原因,單純性眼科遺傳病近300種,其中先天性黑蒙癥(Leber's congenital amaurosis, LCA)是發(fā)生最早、最嚴(yán)重的遺傳性視網(wǎng)膜病變。目前已發(fā)現(xiàn)18種與LCA相關(guān)的致病基因,我們課題組運(yùn)用外顯子組捕獲和新一代高通量測序的方法,發(fā)現(xiàn)NMNAT1基因突變可以導(dǎo)致第9型先天性黑蒙癥。但是具體的突變致病機(jī)制未知。方法：從生物信息學(xué)分析、細(xì)胞學(xué)分析以及CRISPR-Cas9構(gòu)建定點(diǎn)突變小鼠動物模型三方面探究突變可能的致病機(jī)理。生物信息學(xué)分析包括人和小鼠NMNAT1蛋白同源性分析,確保以小鼠作為動物模型的可信性；蛋白晶體結(jié)構(gòu)分析,找到最可能影響蛋白結(jié)構(gòu)的位點(diǎn)作為突變研究對象；蛋白質(zhì)相互作用分析,探索與NMNAT1相互作用的蛋白。細(xì)胞學(xué)分析方面構(gòu)建8種突變和一種野生型重組質(zhì)粒,進(jìn)行熒光共聚焦和熒光定量實(shí)驗(yàn),探究突變對亞細(xì)胞定位和對RNA水平的影響,后續(xù)將進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的Western Blot實(shí)驗(yàn)。CRISPR-Cas9構(gòu)建小鼠動物模型方面,已獲得用于顯微注射的gRNA、Cas9 mRNA和模板DNA,已購買和飼養(yǎng)供體鼠(C57)和受體鼠(ICR),獲得動物模型后將從表型、生化分析、細(xì)胞分子水平等方面全面探索致病機(jī)制,并且探尋可行的治療方法。結(jié)果：人和小鼠NMNAT1蛋白質(zhì)高度同源。蛋白晶體結(jié)構(gòu)分析纈氨酸151(V151)位于蛋白的疏水核心,纈氨酸98(V98)接近配體結(jié)合位點(diǎn),Trp85* (M255)以及Trp169* (M507)無義突變蛋白明顯截短,結(jié)構(gòu)分散。蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測其與多種蛋白存在可能的相互作用。熒光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Trp85*亞細(xì)胞定位有明顯逸散出細(xì)胞核的現(xiàn)象,其他突變亞細(xì)胞定位無異常。熒光定量實(shí)驗(yàn)顯示Trp85*(M255)、Trp169* (M507)無義突變體以及Met35Thr (M104)、Leu153Val(M457)錯(cuò)義突變體RNA水平和野生型差別不大,而Val151Phe(M451)錯(cuò)義突變體RNA水平顯著下降。CRISPR-Cas9構(gòu)建小鼠動物模型方面,已經(jīng)準(zhǔn)備好注射用的RNA和模板DNA。結(jié)論：本研究擬從生物信息學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、組織和器官等多角度闡明NMNAT1突變和先天性黑蒙癥的關(guān)系。目前進(jìn)展順利,已完成前期工作,包括生物信息學(xué)分析,細(xì)胞生物學(xué)的部分分析和CRISPR-Cas9構(gòu)建小鼠動物模型前面部分,后續(xù)將進(jìn)一步探究突變的致病機(jī)制,以及利用藥物治療和基因治療手段研究治療先天性黑蒙癥的可行性,為臨床研究和治療奠定理論基礎(chǔ)。第二部分PHEX基因新發(fā)嵌合突變導(dǎo)致低磷酸鹽血癥性佝僂病X連鎖顯性低磷酸鹽血癥性佝僂病(MIM#307800),是一種遺傳性骨病。主要表現(xiàn)為腎小管對磷酸鹽的重吸收異常、發(fā)育遲緩、身材矮小、骨骼疼痛、牙釉質(zhì)異常、雙下肢畸形、行走無力,X射線提示佝僂病癥狀。該病是由位于X染色體p22.1-22.2上PHEX基因突變造成。在本研究中,我們診斷出一個(gè)患病男孩,其PHEX基因看似雜合,我們擬探尋具體的致病機(jī)制。雖然患者是一名男孩,Sanger測序顯示其X染色體上的PHEX基因有表象上雜合突變,存在雙峰,一個(gè)是正常的堿基“G”,另一個(gè)是“A”。TA克隆測序表明確實(shí)存在這兩種堿基,并且獲得了大致的比率。之后我們用生物信息學(xué)工具預(yù)測以及外顯子捕獲技術(shù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該剪切位點(diǎn)突變對RNA剪切的影響。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)用以檢測PHEx的基因拷貝數(shù)。TA克隆測序?qū)嶒?yàn)顯示正常堿基G和突變堿基A的頻率比為19：13。染色體核型分析結(jié)果顯示病人核型正常,熒光定量PCR檢測基因拷貝數(shù)的結(jié)果驗(yàn)證了核型分析的結(jié)果。這個(gè)剪切突變將會引起外顯子18中4個(gè)堿基丟失,造成移碼突變,蛋白截短,PHEX蛋白的激活位點(diǎn)和Zn2+結(jié)合位點(diǎn)喪失,因此造成腎小管重吸收障礙和骨骼礦化異常。總之,發(fā)生在保守剪切位點(diǎn)的突變將會造成異常的剪切,形成功能受損的蛋白。我們發(fā)現(xiàn)的新發(fā)突變是一個(gè)嵌合突變,可能發(fā)生于前期受精卵階段。本研究對于之后進(jìn)行X連鎖顯性低磷酸鹽血癥性佝僂病的遺傳咨詢時(shí)考慮嵌合突變起到重要的提示作用。
【關(guān)鍵詞】：先天性黑蒙癥 MMNAT1基因 CRISPR-Cas9技術(shù) 小鼠動物模型 X連鎖顯性低磷酸鹽血癥性佝僂病 PHEX基因 嵌合突變
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R-332;R774.1
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-13
• 第一部分 CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建LCA-Nmnat1小鼠動物模型及其發(fā)病機(jī)理研究13-63
• 1 引言13-16
• 2 材料和方法16-44
• 3 結(jié)果44-57
• 4 討論與小結(jié)57-60
• 5 參考文獻(xiàn)60-63
• 第二部分 PHEX基因新發(fā)嵌合突變導(dǎo)致低磷酸鹽血癥性佝僂病63-97
• 1 引言63-64
• 2 材料和方法64-84
• 3 結(jié)果84-91
• 4 討論91-93
• 5 小結(jié)93-94
• 6 參考文獻(xiàn)94-97
• 綜述97-104
• 參考文獻(xiàn)101-104
• 作者簡介及在讀期間所取得的科研成果104-105

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 徐遠(yuǎn)達(dá),蕭正倫,羅煒,黃海鷺;新建一種早期急性呼吸窘迫綜合征的動物模型[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2000年03期

2 富琦,陳信義;建立病證結(jié)合動物模型的新思路[J];中國中醫(yī)藥信息雜志;2003年09期

3 董曉華,張丹參,武海霞;衰老動物模型的研究進(jìn)展及評價(jià)[J];河北北方學(xué)院學(xué)報(bào);2004年06期

4 彭鵬,杜秀平;肺癌動物模型的制作概況[J];徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2005年03期

5 彭炳蔚,任連坤,吳立文;癲沲動物模型的研究進(jìn)展[J];中華神經(jīng)科雜志;2005年10期

6 焦東亮;倪秀石;;短暫性腦缺血發(fā)作的動物模型[J];國外醫(yī)學(xué)(腦血管疾病分冊);2005年10期

7 王斌;武漢;劉恒;;股骨頭缺血性壞死動物模型在中醫(yī)科研中的應(yīng)用[J];長春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2005年04期

8 李才銳,姜德詠;糖尿病視網(wǎng)膜病變動物模型[J];國外醫(yī)學(xué).眼科學(xué)分冊;2005年01期

9 劉穩(wěn);高志強(qiáng);;周圍性面神經(jīng)麻痹的動物模型[J];國際耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2006年02期

10 焦劍;劉武;;實(shí)驗(yàn)性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變動物模型的建立[J];國際眼科雜志;2006年05期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 白躍宏;沈曉艷;曹曼林;;慢性骨筋膜室綜合征動物模型的建立及實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會疼痛學(xué)分會第七屆年會論文摘要集[C];2007年

2 曹敬麗;黃紅云;;癡呆動物模型[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第四屆全國代表大會論文匯編[C];2009年

3 魏瑋;;證候動物模型述評[A];中醫(yī)藥中青年科技創(chuàng)新與成果展示論壇論文集[C];2009年

4 崔軼凡;王慶國;;病證結(jié)合動物模型對中醫(yī)藥研究的意義及建模方法新思路[A];仲景醫(yī)學(xué)求真（續(xù)三）[C];2009年

5 魏瑋;;證候動物模型述評[A];自主創(chuàng)新與持續(xù)增長第十一屆中國科協(xié)年會論文集（3）[C];2009年

6 徐國會;勵建安;王彤;周士枋;;慢性冠狀動脈狹窄及側(cè)枝循環(huán)的動物模型[A];中國康復(fù)醫(yī)學(xué)會第四屆會員代表大會暨第三屆中國康復(fù)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2001年

7 胡連生;李忠卓;劉海軍;張鐵民;;肝火上擾型耳聾動物模型的實(shí)驗(yàn)初探[A];中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會成立20周年紀(jì)念大會論文集[C];2001年

8 苗明三;方曉艷;孫艷紅;;氣血雙虛動物模型的復(fù)制[A];首屆中國中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動物科技交流會論文匯編[C];2002年

9 秦任甲;;高黏滯動物模型[A];中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第六次會員代表大會暨學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2004年

10 張如意;艾厚喜;葉翠飛;李林;;擬抽動動物模型的建立及評價(jià)[A];中國神經(jīng)科學(xué)學(xué)會第六屆學(xué)術(shù)會議暨學(xué)會成立十周年慶祝大會論文摘要匯編[C];2005年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 丁萍　丁香;“讓我代表動物懲罰你”[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2009年

2 吉林工程技術(shù)師范學(xué)院職業(yè)教育學(xué)院 王哲;試述心理學(xué)前瞻性記憶模型研究進(jìn)展[N];吉林日報(bào);2010年

3 張剛強(qiáng);生物醫(yī)學(xué)和藥物研究動物模型規(guī)劃研討會召開[N];中國醫(yī)藥報(bào);2010年

4 記者 衣曉峰 通訊員 吳丹;新血管內(nèi)膜增生動物模型研制成功[N];健康報(bào);2013年

5 記者 譚欣;創(chuàng)新建立中醫(yī)證候動物模型[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2013年

6 裘 索;中醫(yī)藥現(xiàn)代化若干問題的思考[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2004年

7 新華社記者 毛磊;人應(yīng)該學(xué)會與動物共存[N];新華每日電訊;2003年

8 趙琰 屈會化 王慶國;建立病證結(jié)合理想模型的新思路[N];中國醫(yī)藥報(bào);2006年

9 李荔;牛昱宇：轉(zhuǎn)基因獼猴培育成功[N];北京科技報(bào);2010年

10 本報(bào)記者 何世文;我們也是沒有硝煙戰(zhàn)場上的戰(zhàn)士[N];科技日報(bào);2003年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王玉芝;玉屏銀屑方對濕熱證型銀屑病動物模型免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2013年

2 柴亮;自身免疫性內(nèi)耳病動物模型的建立和凋亡及其相關(guān)蛋白在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性內(nèi)耳病的表達(dá)[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2003年

3 朱峰;炎癥性腸病免疫動物模型的建立及其發(fā)病機(jī)制和藥物治療的探討[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1997年

4 成俊;腰椎融合動物模型的建立及生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究[D];四川大學(xué);2006年

5 隰建成;椎間盤源性下腰痛動物模型的建立及行為學(xué)觀察[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2006年

6 姜偉洲;基于中醫(yī)理論的肺陰虧虛、寒邪犯肺證動物模型的建立及相關(guān)理論的研究[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2010年

7 徐冰;常見人體腫瘤轉(zhuǎn)移動物模型的建立及相關(guān)機(jī)理研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2007年

8 袁靜;兩種微生態(tài)學(xué)動物模型的建立及其在抗菌藥物殘留安全評估中的應(yīng)用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2009年

9 郭淑貞;血瘀證（心肌缺血）動物模型及其相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2007年

10 林曉靜;過熱復(fù)合脂多糖致熱射病大鼠動物模型多器官急性損傷的實(shí)驗(yàn)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2009年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 章敏貴;放射性淚腺損傷動物模型的建立、病理生理機(jī)制研究及Gadd45 α在其損傷修復(fù)中作用的探討[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 毛雅琴;幽門螺桿菌國內(nèi)流行株動物模型的建立[D];浙江大學(xué);2015年

3 孫志文;病毒介導(dǎo)反義CK13基因?qū)θ吮茄拾〩NE1細(xì)胞動物模型放療敏感性的影響[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

4 李帥杰;前列腺2μm激光切除術(shù)后尿道上皮修復(fù)機(jī)制研究的動物模型的建立[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2016年

5 李金軒;一種新型脊髓壓迫動物模型的建立及自噬因子beclin1表達(dá)研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2016年

6 袁育韜;胃癌原位種植淋巴轉(zhuǎn)移動物模型的建立[D];南京大學(xué);2016年

7 崔丹;調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在吉蘭—巴雷綜合征動物模型中免疫機(jī)制的研究[D];蚌埠醫(yī)學(xué)院;2016年

8 陳姣;CR1SPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建LCA-Nmnat1小鼠動物模型及其發(fā)病機(jī)理研究和PHEX基因新發(fā)嵌合突變導(dǎo)致低磷酸鹽血癥性佝僂病[D];浙江大學(xué);2016年

9 于仁朝;大鼠異側(cè)頸總動脈端側(cè)吻合動物模型的制作及評價(jià)[D];蚌埠醫(yī)學(xué)院;2016年

10 張大偉;血栓閉塞性脈管炎動物模型的研制[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2001年

，

本文編號：747925