本文關(guān)鍵詞：酪氨酸激酶Src與E3泛素連接酶Trim13在天然免疫應(yīng)答中的調(diào)控作用和機(jī)制研究

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【摘要】：天然免疫(innate immunity)是機(jī)體抗感染的第一道防線,它可以在早期識(shí)別并消滅入侵的病原微生物。機(jī)體通過(guò)模式識(shí)別受體(PRRs)識(shí)別病原體的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)隨后激活相關(guān)信號(hào)通路,最終導(dǎo)致I型干擾素(IFN)、白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNFα)等細(xì)胞因子的分泌,從而起到抵抗病原微生物感染的作用。但是過(guò)強(qiáng)的天然免疫應(yīng)答也可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng),造成病理性組織損傷。為了確保機(jī)體抵抗入侵的同時(shí)保護(hù)自身組織,天然免疫的調(diào)控顯得至關(guān)重要。磷酸化修飾和泛素化修飾是兩種重要的翻譯后修飾,研究表明他們?cè)跈C(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,廣泛的參與免疫應(yīng)答的各個(gè)階段。我們課題組的研究方向主要集中在研究翻譯后修飾對(duì)于天然免疫的調(diào)控作用及相關(guān)分子機(jī)制,我們近三年研究了TANK結(jié)合酶1(TBK1)的磷酸化調(diào)控以及E3泛素連接酶Trim13介導(dǎo)的天然免疫調(diào)節(jié)。TANK結(jié)合激酶1(TBK1)作為抗病毒應(yīng)答中關(guān)鍵的激酶分子,其活性的調(diào)控一直是分子免疫學(xué)研究的重點(diǎn)。然而到目前為止,關(guān)于TBK1活化的調(diào)控卻知之甚少。因此在本論文的第一部分中將重點(diǎn)尋找并探索TBK1活化相關(guān)分子。我們首先從尋找天然免疫過(guò)程中TBK1的磷酸化位點(diǎn)出發(fā),觀察TBK1各個(gè)酪氨酸殘基非活性突變體在抗病毒天然免疫應(yīng)答中的作用,尋找到除Ser172外又一個(gè)對(duì)于TBK1活化十分重要的磷酸化位點(diǎn)——Tyr179。我們通過(guò)Western Blot以及ELISA技術(shù)確認(rèn)TBK1的Tyr179的磷酸化對(duì)其Ser172位自我磷酸化以及隨后I型IFN的產(chǎn)生具有重要意義。接下來(lái)我們通過(guò)質(zhì)譜分析找到能與TBK1復(fù)合物相互作用的酪氨酸激酶——Src。Src激酶為Src家族激酶(SFK)的一員,由一個(gè)N端的SH4結(jié)構(gòu)域、一個(gè)獨(dú)有(unique)結(jié)構(gòu)域、一個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域、一個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域以及C端的激酶結(jié)構(gòu)域組成。作為一個(gè)非受體酪氨酸激酶,Src可以介導(dǎo)多種底物的酪氨酸磷酸化修飾從而參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、存活、粘附以及細(xì)胞能動(dòng)性等多種生命進(jìn)程。為了探索Src激酶在抗病毒應(yīng)答中的作用,我們利用Src抑制劑或構(gòu)建Src缺失細(xì)胞系來(lái)抑制Src的活性或表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)Src的缺失可以抑制TBK1-IRF3信號(hào)通路的活化以及I型IFN的產(chǎn)生,但是并不影響NF-κB及MAPK信號(hào)通路。最后我們通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明Src作用于接頭分子TRIF,MAVS,STING調(diào)控的信號(hào)通路而不影響MyD88信號(hào)通路。通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)以及GST-融合蛋白,我們發(fā)現(xiàn)Src通過(guò)與TRIF,MAVS或STING形成復(fù)合物來(lái)間接調(diào)控TBK1的Tyr179磷酸化,最終調(diào)控TBK1-IRF3信號(hào)通路的活化和I型IFN的產(chǎn)生。通過(guò)本部分的研究,我們不僅發(fā)現(xiàn)了TBK1活化相關(guān)的又一磷酸化位點(diǎn)——tyr179,還尋找到調(diào)控該位點(diǎn)磷酸化的酪氨酸激酶——src。在受到病毒刺激后,src可以通過(guò)與接頭分子trif,mavs或sting形成復(fù)合物來(lái)募集tbk1并介導(dǎo)其tyr179位磷酸化,隨后促進(jìn)tbk1在172位絲氨酸殘基上發(fā)生自我磷酸化及活化,活化的tbk1則進(jìn)一步激活轉(zhuǎn)錄因子irf3并促進(jìn)其入核,最終促進(jìn)i型ifn的產(chǎn)生。該研究深化了tbk1-irf3的活化機(jī)制,揭示了src在抗病毒天然免疫反應(yīng)中的重要作用。除了磷酸化,泛素化修飾在天然免疫調(diào)控中也占有重要的地位。作為泛素化修飾過(guò)程中的關(guān)鍵分子,e3泛素連接酶也是天然免疫調(diào)控研究的重點(diǎn)對(duì)象。在第二部分的研究中,結(jié)合基因芯片及文獻(xiàn)查閱結(jié)果,我們認(rèn)為trim家族的e3泛素連接酶trim13可能參與調(diào)控天然免疫應(yīng)答,因此我們對(duì)其展開(kāi)了進(jìn)一步研究。目前關(guān)于trim13在天然免疫中的調(diào)控作用及作用機(jī)制研究尚不完全。為了探索trim13在天然免疫相關(guān)信號(hào)通路中的作用,我們首先利用trim13特異性小rna干擾raw264.7細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)trim13表達(dá)降低抑制vsv病毒誘導(dǎo)的ifn-β的表達(dá),而促進(jìn)hsv-1病毒及l(fā)ps刺激后ifn-β及il-6的表達(dá)。相反,在raw264.7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)trim13可以促進(jìn)vsv病毒誘導(dǎo)的ifn-β的表達(dá),而抑制hsv-1病毒及l(fā)ps刺激后的ifn-β及il-6的表達(dá)。為了更深入的探索trim13的天然免疫調(diào)控功能,我們建立了trim13的基因敲除(trim13-ko)小鼠,并利用trim13-ko和野生型(trim13-wt)小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞和骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞來(lái)重復(fù)以上的刺激實(shí)驗(yàn),得到了與干擾實(shí)驗(yàn)一致的結(jié)果。這些結(jié)果表明在多種巨噬細(xì)胞中trim13對(duì)于不同的病原微生物可能發(fā)揮著天然免疫應(yīng)答雙向調(diào)控作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在腹腔注射李斯特菌4小時(shí)后,trim13-ko小鼠血清中tnfα及il-6的含量明顯高于trim13-wt小鼠,而腹腔注射vsv病毒12小時(shí)后,trim13-ko小鼠血清中tnf-α、il-6及ifn-β的含量明顯低于trim13-wt小鼠。因此我們推測(cè)trim13對(duì)天然免疫過(guò)程具有雙向調(diào)節(jié)作用,即他可以正向調(diào)控rna病毒誘導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答,而負(fù)向調(diào)控dna病毒及tlr配體誘導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答反應(yīng)。接下來(lái)我們進(jìn)一步研究了trim13介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)控作用。在hek293t細(xì)胞中,高表達(dá)trim13能夠明顯抑制trif及sting誘導(dǎo)的ifn-β和nf-κb報(bào)告基因的活化,而促進(jìn)rig-i誘導(dǎo)的的ifn-β和nf-κb報(bào)告基因的活化。但是trim13高表達(dá)對(duì)于myd88誘導(dǎo)的ifn-β和nf-κb報(bào)告基因的活化無(wú)顯著影響。這提示我們trim13可能參與調(diào)控多條天然免疫相關(guān)信號(hào)通路。westernblot結(jié)果顯示trim13過(guò)表達(dá)可以降低sting的表達(dá)水平,但是并不影響trif,myd88的表達(dá)水平,這提示我們trim13可能參與sting的泛素化修飾和降解。通過(guò)本部分的研究,我們發(fā)現(xiàn)e3泛素連接酶trim13在天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮著雙向調(diào)控作用,而關(guān)于trim13在天然免疫應(yīng)答信號(hào)通路中的作用機(jī)制,如Trim13的相互作用分子以及Trim13介導(dǎo)的泛素化修飾的蛋白底物和泛素化修飾類(lèi)型,還有待于進(jìn)一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：天然免疫 Src Trim13 TBK1 STING
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 縮略詞表12-14
• 第一部分 酪氨酸激酶Src通過(guò)活化TBK1調(diào)控抗病毒天然免疫應(yīng)答 .14-49
• 一、引言14-16
• 二、材料與方法16-25
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-46
• 四、討論46-48
• 五、總結(jié)48-49
• 第二部分 E3泛素連接酶Trim13在天然免疫應(yīng)答中的功能及機(jī)制研究49-75
• 一、引言49-51
• 二、材料與方法51-54
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-72
• 四、討論72-74
• 五、小結(jié)74-75
• 參考文獻(xiàn)75-81
• 綜述 Trim蛋白與天然免疫及腫瘤的研究進(jìn)展81-111
• 一.概述82-87
• 二.Trim蛋白在天然免疫中的作用87-93
• 三.Trim蛋白與腫瘤93-98
• 小結(jié)98-99
• 參考文獻(xiàn)99-111
• 研究生期間發(fā)表的論文和國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)交流111-112
• 致謝112

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本文編號(hào)：725372