發(fā)布時(shí)間：2017-08-21 19:02

  本文關(guān)鍵詞：生物反應(yīng)器（VERO細(xì)胞）培養(yǎng)森腦病毒工藝的摸索

  更多相關(guān)文章： Vero細(xì)胞 森林腦炎病毒 生物反應(yīng)器 片狀載體

【摘要】：目的利用籃式生物反應(yīng)器進(jìn)行vero細(xì)胞、森林腦炎病毒的高密度培養(yǎng),探索森林腦炎病毒滅活疫苗制備工藝。森林腦炎病毒液經(jīng)超濾濃縮、β-丙內(nèi)酯滅活、柱層析純化,為生物反應(yīng)器制備森林腦炎病毒滅活疫苗的生產(chǎn)工藝和生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)工藝積累經(jīng)驗(yàn)。方法使用5L、14L籃式生物反應(yīng)器配合片狀載體培養(yǎng)vero細(xì)胞,在細(xì)胞培養(yǎng)階段,檢測(cè)平臺(tái)期細(xì)胞密度,并從生物反應(yīng)器接種細(xì)胞量、灌流速度、培養(yǎng)液等方面優(yōu)化vero細(xì)胞的培養(yǎng)條件。病毒培養(yǎng)階段,檢測(cè)病毒滴度變化,并通過病毒感染復(fù)數(shù)、維持液小牛血清濃度、培養(yǎng)基灌流速度等方面優(yōu)化病毒培養(yǎng)條件,從而提高病毒收獲液病毒滴度,并使病毒收獲維持較長(zhǎng)的時(shí)間。在整個(gè)生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中,檢測(cè)培養(yǎng)液中PH、DO葡萄糖濃度、乳酸濃度、滲透壓的變化,通過這一系列的指標(biāo)來確定生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)的參數(shù)。收獲的病毒液超濾濃縮、滅活后,經(jīng)Sepharose 4FF柱層析純化得到疫苗原液,按照《中國(guó)藥典》三部(2010版)進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。結(jié)果經(jīng)反復(fù)試驗(yàn),得到比較適合生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)條件為:細(xì)胞培養(yǎng)階段PH為7.2,DO為50~60%,vero細(xì)胞的最佳接種量為5~7.5×105cell/ml;病毒培養(yǎng)階段PH為7.4,DO為45~55%,病毒的最佳感染復(fù)數(shù)為0.1~0.04。細(xì)胞到達(dá)平臺(tái)期時(shí)最高細(xì)胞密度可達(dá)到1.04×107cell/ml;病毒感染后,約3天左右病毒滴度可以達(dá)到8.0 log LD50/m L,每日病毒收獲約一個(gè)罐體積,收獲時(shí)間可達(dá)30~35天,平均病毒滴度為8.4 log LD50/m L。將森腦病毒液通過截留分子量為300KD的Millipore膜包進(jìn)行超濾濃縮,按0.025%(體積比為1:4000)加入β-丙內(nèi)酯在4℃滅活48小時(shí)可滅活完全。經(jīng)Sepharose 4FF柱層析純化后得到疫苗原液,其雜蛋白去除率高達(dá)87.7%,其中抗原含量、小牛血清白蛋白、vero細(xì)胞宿主蛋白的殘留量均符合藥典規(guī)定。結(jié)論利用生物反應(yīng)器進(jìn)行Vero細(xì)胞培養(yǎng)制備森林腦炎病毒,條件易于控制,能大量節(jié)約勞動(dòng)成本,有效減少污染的機(jī)率,能得到較高的細(xì)胞密度并獲得高毒力的病毒收獲液,為生物反應(yīng)器制備vero細(xì)胞森林腦炎病毒滅活疫苗生產(chǎn)工藝奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：Vero細(xì)胞 森林腦炎病毒 生物反應(yīng)器 片狀載體
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R373.31
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 前言11-18
• 1 森林腦炎病毒的生物學(xué)特性11-12
• 2 森林腦炎的流行病學(xué)特征12-13
• 3 森林腦炎的診斷、預(yù)防及治療13-15
• 3.1 森林腦炎的診斷13-14
• 3.2 森林腦炎的預(yù)防和治療14-15
• 4 森林腦炎疫苗的研究現(xiàn)狀15-16
• 5 細(xì)胞生物反應(yīng)器的發(fā)展及種類16-17
• 6 微載體培養(yǎng)技術(shù)17-18
• 材料與儀器18-22
• 1 材料18-20
• 1.1 細(xì)胞18
• 1.2 毒種18
• 1.3 主要試劑18
• 1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18
• 1.5 常用溶液配制18-20
• 2 儀器20-22
• 方法22-32
• 1 生物反應(yīng)器參數(shù)調(diào)節(jié)及滅菌22-23
• 1.1 pH電極的校正22
• 1.2 溶氧電極校正22
• 1.3 攪拌速度22
• 1.4 溫度22
• 1.5 pH值22
• 1.6 溶氧22-23
• 1.7 生物反應(yīng)器高壓滅菌23
• 3 細(xì)胞培養(yǎng)23-24
• 3.1 vero細(xì)胞的復(fù)蘇23
• 3.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)23-24
• 4 片狀載體細(xì)胞計(jì)數(shù)24
• 4.1 結(jié)晶紫染色計(jì)數(shù)法24
• 4.2 胰酶消化計(jì)數(shù)法24
• 5 細(xì)胞接種24
• 6 病毒培養(yǎng)24-25
• 6.1 病毒接種及培養(yǎng)24-25
• 6.2 MOI計(jì)算25
• 7 原液制備25
• 7.1 超濾濃縮25
• 7.2 病毒的滅活25
• 7.3 柱層析純化25
• 8 檢測(cè)25-32
• 8.1 葡萄糖濃度測(cè)定25-26
• 8.2 乳酸濃度測(cè)定26
• 8.3 培養(yǎng)液滲透壓檢測(cè)26-27
• 8.4 病毒滴度檢測(cè)27
• 8.5 病毒滅活安全試驗(yàn)27
• 8.6 抗原含量檢測(cè)27-28
• 8.7 小牛血清殘留量檢測(cè)28-29
• 8.8 Vero細(xì)胞宿主蛋白檢測(cè)29
• 8.9 Lowry法檢測(cè)蛋白含量檢測(cè)29-30
• 8.10 DNA殘留量檢測(cè)30-32
• 結(jié)果32-39
• 1 片狀載體細(xì)胞計(jì)數(shù)32-33
• 1.1 兩種不同細(xì)胞計(jì)數(shù)法的比較32
• 1.2 不同細(xì)胞接種濃度對(duì)平臺(tái)期細(xì)胞密度的影響32-33
• 2 培養(yǎng)基中葡萄糖、乳酸濃度分析33-34
• 3 滲透壓的影響34
• 4 不同細(xì)胞接種濃度對(duì)病毒滴度的影響34-36
• 5 MOI（感染復(fù)數(shù)）對(duì)病毒增殖的影響36-37
• 6 不同小牛血清濃度對(duì)病毒滴度的影響37-38
• 7 四批樣品檢定結(jié)果38-39
• 結(jié)論39-40
• 討論40-43
• 1 片狀載體的細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法40
• 2 葡萄糖、乳酸、滲透壓的影響40-41
• 3 細(xì)胞密度、感染復(fù)數(shù)對(duì)病毒產(chǎn)量的影響41-43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 致謝47

【參考文獻(xiàn)】

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3 董關(guān)木,宋宗明,劉文雪,安祺,王曉理,王顯軍,韓亮,濤波,孔艷,楊立宏;森林腦炎純化疫苗接種反應(yīng)和免疫學(xué)效果觀察[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2005年06期

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

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本文編號(hào)：714565