本文關(guān)鍵詞：泛素和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)和鑒定

  更多相關(guān)文章： 泛素 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 內(nèi)吞 胞內(nèi)體分選

【摘要】：胞內(nèi)體蛋白分選是泛素調(diào)控內(nèi)吞作用中的關(guān)鍵步驟,不僅參與養(yǎng)分,代謝物,激素和生長因子的攝取,分選及處理;維持極性上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)膜功能域的分布特點(diǎn);受體和配體的再循環(huán)等多種過程,而且對于維持細(xì)胞的許多重要生理功能(如細(xì)胞周期的調(diào)控、抗原遞呈、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等)有著極其重要的作用。目前發(fā)現(xiàn)的許多遺傳性和獲得性疾病(如腫瘤、囊性纖維化)的發(fā)生都與此途徑功能失調(diào)相關(guān)。它也參與了機(jī)體抑制腫瘤、神經(jīng)變性性疾病以及感染性疾病等病理過程,這說明其在細(xì)胞內(nèi)具有非常重要的功能。胞內(nèi)體蛋白分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)能將被泛素標(biāo)記的蛋白分選入溶酶體途徑進(jìn)行降解。ESCRT也在胞質(zhì)分裂和病毒出芽過程中發(fā)揮重要作用。泛素-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Ubiquitin-Transferrin receptor,Ub-Tf R)嵌合蛋白由于有泛素標(biāo)記轉(zhuǎn)鐵蛋白受體,使其在胞內(nèi)體上被分選進(jìn)入多泡體/溶酶體的降解途徑,而不是沿著轉(zhuǎn)鐵蛋白受體通過再循環(huán)內(nèi)體回到細(xì)胞質(zhì)膜的經(jīng)典途徑,是研究胞內(nèi)體蛋白分選途徑共同機(jī)制的理想標(biāo)記之一。所以我們通過構(gòu)建泛素和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建,為下一步的研究胞內(nèi)體分選相關(guān)蛋白奠定基礎(chǔ)。方法:1.構(gòu)建泛素表達(dá)載體采用PCR擴(kuò)增小鼠泛素基因,經(jīng)過雙酶切,將泛素基因克隆于表達(dá)載體p CI-neo-HA中,測序正確后提取質(zhì)粒。2.泛素載體的表達(dá)測序正確的泛素表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,裂解細(xì)胞,收集細(xì)胞裂解液。通過Western blot檢測泛素蛋白的表達(dá)。3.構(gòu)建轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)載體采用PCR擴(kuò)增人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因,經(jīng)過雙酶切,將轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因克隆于表達(dá)載體p CI-neo-HA中,測序正確后提取質(zhì)粒。4.轉(zhuǎn)鐵蛋白受體載體的表達(dá)及鑒定測序正確的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,裂解細(xì)胞,收集細(xì)胞裂解液。通過Western blot、免疫熒光等檢測轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá)。結(jié)果:1.泛素蛋白載體的構(gòu)建、表達(dá)及鑒定通過設(shè)計(jì)特異性引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增得到泛素基因片段約285bp,與預(yù)期相符;將擴(kuò)增產(chǎn)物純化與載體質(zhì)粒p Cl-neo-HA酶切后連接,送公司測序。測序正確后,轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后裂解細(xì)胞,離心獲得細(xì)胞裂解液。Western Blot鑒定蛋白分子量為10KDa,表明為目的蛋白。2.人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建、表達(dá)及鑒定通過設(shè)計(jì)特異性引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增得到轉(zhuǎn)鐵蛋白受體基因片段約2309bp,與預(yù)期相符;將擴(kuò)增產(chǎn)物純化與載體質(zhì)粒p Cl-neo-HA酶切后連接,送公司測序。測序正確后,轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后裂解細(xì)胞,離心獲得細(xì)胞裂解液。Western Blot鑒定蛋白分子量為90KDa,表明為目的蛋白。免疫熒光證實(shí)了轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞后被分選循環(huán)回細(xì)胞膜的內(nèi)吞途徑。結(jié)論:1.成功構(gòu)建了p Cl-neo-Ub表達(dá)質(zhì)粒,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后表達(dá)的泛素蛋白明顯增高。2.成功構(gòu)建了p Cl-neo-Tf R表達(dá)質(zhì)粒,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體蛋白明顯增高,并證實(shí)了轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞后的循環(huán)途徑,為下一步構(gòu)建泛素-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體嵌合蛋白和進(jìn)一步研究胞內(nèi)體分選相關(guān)蛋白奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：泛素 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 內(nèi)吞 胞內(nèi)體分選
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-14
• 第一部分 泛素蛋白表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建、表達(dá)和鑒定14-28
• 1 材料與方法14-24
• 2 結(jié)果24-27
• 3 討論27-28
• 第二部分 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建、表達(dá)和鑒定28-45
• 1 材料與方法28-38
• 2 結(jié)果38-44
• 3 討論44-45
• 小結(jié)45-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 綜述50-62
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 縮略詞表62-63
• 在讀期間發(fā)表的論文63-64
• 致謝64

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