發(fā)布時間：2017-08-12 23:03

  本文關(guān)鍵詞：RNA-Seq揭示輪狀病毒感染引起的固有免疫研究

  更多相關(guān)文章： 輪狀病毒感染 腸上皮細胞 固有免疫 轉(zhuǎn)錄組測序 IFNλ1表達 信號通路

【摘要】：為了揭示輪狀病毒在感染過程中宿主與其相互作用的相關(guān)基因,本研究使用實驗室自主分離的輪狀病毒CC0812-1毒株感染腸上皮細胞系HT29,病毒使用滴度1TCID50/cell,感染后12h提取HT29細胞總RNA用Illumina HiSeq 2500進行轉(zhuǎn)錄組測序。將其與未感染的HT29細胞轉(zhuǎn)錄組進行比較篩選得到473個差異表達基因,病毒感染的HT29細胞中418個基因表達量上調(diào),55個基因表達量下調(diào)。通過KEGG分析,有82個差異表達基因注釋到12條免疫相關(guān)的信號通路中,其中大部分差異表達基因廣泛參與到病原相關(guān)分子模式識別、補體系統(tǒng)調(diào)節(jié)、細胞因子反應(yīng)、細胞凋亡等抗病毒反應(yīng)相關(guān)的信號傳導途徑中,為驗證RNA-Seq技術(shù)開展病毒感染后轉(zhuǎn)錄組研究的可靠性,我們隨機選取7個差異表達基因以qRT-PCR方法進行檢驗,結(jié)果顯示這些基因的變化趨勢與RNA-Seq具有一致性,證明RNA-Seq技術(shù)是篩選差異表達基因的一種可行方法。通過RNA-Seq篩選得到的473個差異表達基因為輪狀病毒與宿主相互作用以及輪狀病毒引起的固有免疫反應(yīng)研究提供了潛在靶基因。本研究為探究輪狀病毒上調(diào)IFN λ1 mRNA表達的機制,使用滴度為1TCID50/cell的輪狀病毒CC0812-1株分別感染腸上皮細胞系HT29和HCT116,感染后6h、12h、24h提取細胞總RNA,通過qRT-PCR檢測IFN λ1 mRNA的表達水平,結(jié)果顯示輪狀病毒引起的IFN λ1 mRNA表達上調(diào)具有時間依賴性,感染后6hIFN λ1 mRNA表達開始上調(diào)(HT29上調(diào)11.54倍,HCT1164.96倍),感染后12 h IFN λ1 mRNA上調(diào)表達最高(HT29上調(diào)82.56倍,HCT11643.41倍),感染后24 h IFN λ1 mRNA上調(diào)表達又有所降低(HT29上調(diào)66.76倍,HCT11622.83倍)。使用不同滴度(0.01 TCID50/cell、0.1 TCID50/cell、1TCID50/cell的輪狀病毒CC0812-1株分別感染腸上皮細胞系HT29和HCT116,感染后12h提取細胞總RNA,通過qRT-PCR檢測IFN λ1 mRNA的表達水平,結(jié)果顯示輪狀病毒引起的IFN λ1 mRNA上調(diào)表達具有病毒滴度依賴性,隨著病毒感染滴度的增加,IFN λ1 mRNA上調(diào)表達水平亦逐漸增加,滴度為0.01 TCID50/cell病毒誘導HT29和HCT116細胞中IFN λ1 mRNA分別上調(diào)表達2.03倍和2.02倍,滴度為0.1 TCID50/cell病毒誘導HT29和HCT116細胞中IFN λ1 mRNA分別上調(diào)表達10.29倍和11.59倍,滴度為1 TCID50/cell病毒誘導HT29和HCT116細胞中IFN λ1 mRNA分別上調(diào)表達82.56倍和43.41倍。與此同時,選擇滴度為1TCID50/cell的輪狀病毒感染12 h后,qRT-PCR檢測顯示細胞內(nèi)識別外源dsRNA的模式識別受體RIG-I與MDA5和幾種重要的IRF(IRF1、 IRF3、IRF7、IRF9)均顯著上調(diào)表達,感染的HT29細胞中RIG-I、MDA5、IRF1、 IRF3、IRF7、IRF9 mRNA分別上調(diào)表達5.3、5.67、4.96、1.72、3.61和1.50倍,感染的HCT116細胞中RIG-I、MDA5、IRF1、IRF3、IRF7、IRF9 mRNA分別上調(diào)表達2.35、2.20、2.32、1.49、2.52和1.64倍。通過RIG-I siRNA、MDA5 siRNA單獨干擾的HCT116細胞、RIG-I siRNA和MDA5 siRNA同時干擾的HCT116細胞與正常組細胞感染病毒12h后相比其IFN λ1 mRNA表達依次為后者的0.37、0.73與0.27倍。結(jié)果表明干擾HCT116細胞內(nèi)RIG-I與MDA5后輪狀病毒感染誘導的IFN λ1 mRNA上調(diào)表達受到抑制,由此我們初步推斷,宿主細胞主要通過RIG-I/MDA5識別輪狀病毒感染,且激活下游信號通路引起IFN λ1表達。
【關(guān)鍵詞】：輪狀病毒感染 腸上皮細胞 固有免疫 轉(zhuǎn)錄組測序 IFNλ1表達 信號通路
【學位授予單位】：華中師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第1章 文章綜述13-26
• 1.1 輪狀病毒簡述13-19
• 1.1.1 發(fā)現(xiàn)13
• 1.1.2 輪狀病毒分類與結(jié)構(gòu)13-14
• 1.1.3 輪狀病毒復制周期14-16
• 1.1.4 輪狀病毒傳播途徑與致病機制16-17
• 1.1.5 輪狀病毒免疫17-19
• 1.2 高通量轉(zhuǎn)錄組測序19-25
• 1.2.1 轉(zhuǎn)錄組學概述19-20
• 1.2.2 第二代測序技術(shù)20-24
• 1.2.3 RNA-Seq在病毒與宿主相互作用研究中的應(yīng)用24-25
• 1.3 本課題研究思路25-26
• 第2章 轉(zhuǎn)錄組測序揭示抗輪狀病毒相關(guān)免疫基因26-56
• 2.1 實驗材料26-28
• 2.1.1 細胞系26
• 2.1.2 病毒株26
• 2.1.3 主要試劑26
• 2.1.4 細胞培養(yǎng)液26-27
• 2.1.5 主要儀器與耗材27-28
• 2.2 實驗方法28-35
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)、凍存與復蘇28
• 2.2.2 輪狀病毒增殖28-29
• 2.2.3 輪狀病毒滴度測定29-30
• 2.2.4 輪狀病毒感染HT29細胞30
• 2.2.5 細胞總RNA提取30
• 2.2.6 細胞總RNA質(zhì)量檢測30-31
• 2.2.7 測序文庫構(gòu)建31
• 2.2.8 文庫質(zhì)控與測序31
• 2.2.9 測序數(shù)據(jù)處理31-32
• 2.2.10 與參考基因組比對分析32-33
• 2.2.11 實時熒光定量PCR鑒定RNA-Seq的準確性33-35
• 2.3 實驗結(jié)果35-52
• 2.3.1 輪狀病毒細胞病變效應(yīng)35-36
• 2.3.2 病毒效價36-37
• 2.3.3 細胞總RNA提取37
• 2.3.4 細胞總RNA樣品質(zhì)量檢測37-38
• 2.3.5 測序數(shù)據(jù)及質(zhì)量分析38-39
• 2.3.6 對統(tǒng)計39
• 2.3.7 轉(zhuǎn)錄組文庫質(zhì)量評估39-41
• 2.3.8 基因表達定量分析41-43
• 2.3.9 基因差異表達分析43-47
• 2.3.10 免疫相關(guān)基因差異表達47-51
• 2.3.11 熒光定量PCR驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果51-52
• 2.4 討論52-56
• 2.4.1 RNA-seq數(shù)據(jù)質(zhì)量與可靠性52-53
• 2.4.2 輪狀病毒感染前后宿主細胞轉(zhuǎn)錄組變化討論53-56
• 第3章 RV誘導腸上皮細胞產(chǎn)生IFNλ1的機制初步探究56-65
• 3.1 實驗材料56
• 3.1.1 細胞系56
• 3.1.2 病毒株56
• 3.1.3 主要試劑56
• 3.1.4 主要儀器設(shè)備56
• 3.2 實驗方法56-58
• 3.2.1 輪狀病毒感染HT29與HCT116細胞系56-57
• 3.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染HCT116細胞57
• 3.2.3 RNA提取、cDNA合成及qRT-PCR檢測mRNA表達水平57
• 3.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析57-58
• 3.3 實驗結(jié)果58-62
• 3.3.1 RV誘導腸上皮細胞IFNλ1上調(diào)表達58-59
• 3.3.2 RV誘導腸上皮細胞dsRNA受體RIG-I/MDA 5 mRNA上調(diào)表達59-60
• 3.3.3 RV誘導腸上皮細胞IRF mRNA上調(diào)表達60-61
• 3.3.4 RIG-I/MDA5信號通路激活I(lǐng)FNλ1表達61-62
• 3.4 討論62-65
• 參考文獻65-72
• 英文縮寫表72-73
• 碩士期間發(fā)表的論文73-74
• 致謝74

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本文編號：664080