本文關(guān)鍵詞：RNA-Seq揭示輪狀病毒感染引起的固有免疫研究

  更多相關(guān)文章： 輪狀病毒感染 腸上皮細(xì)胞 固有免疫 轉(zhuǎn)錄組測序 IFNλ1表達(dá) 信號通路

【摘要】：為了揭示輪狀病毒在感染過程中宿主與其相互作用的相關(guān)基因,本研究使用實(shí)驗(yàn)室自主分離的輪狀病毒CC0812-1毒株感染腸上皮細(xì)胞系HT29,病毒使用滴度1TCID50/cell,感染后12h提取HT29細(xì)胞總RNA用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。將其與未感染的HT29細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較篩選得到473個差異表達(dá)基因,病毒感染的HT29細(xì)胞中418個基因表達(dá)量上調(diào),55個基因表達(dá)量下調(diào)。通過KEGG分析,有82個差異表達(dá)基因注釋到12條免疫相關(guān)的信號通路中,其中大部分差異表達(dá)基因廣泛參與到病原相關(guān)分子模式識別、補(bǔ)體系統(tǒng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等抗病毒反應(yīng)相關(guān)的信號傳導(dǎo)途徑中,為驗(yàn)證RNA-Seq技術(shù)開展病毒感染后轉(zhuǎn)錄組研究的可靠性,我們隨機(jī)選取7個差異表達(dá)基因以qRT-PCR方法進(jìn)行檢驗(yàn),結(jié)果顯示這些基因的變化趨勢與RNA-Seq具有一致性,證明RNA-Seq技術(shù)是篩選差異表達(dá)基因的一種可行方法。通過RNA-Seq篩選得到的473個差異表達(dá)基因?yàn)檩啝畈《九c宿主相互作用以及輪狀病毒引起的固有免疫反應(yīng)研究提供了潛在靶基因。本研究為探究輪狀病毒上調(diào)IFN λ1 mRNA表達(dá)的機(jī)制,使用滴度為1TCID50/cell的輪狀病毒CC0812-1株分別感染腸上皮細(xì)胞系HT29和HCT116,感染后6h、12h、24h提取細(xì)胞總RNA,通過qRT-PCR檢測IFN λ1 mRNA的表達(dá)水平,結(jié)果顯示輪狀病毒引起的IFN λ1 mRNA表達(dá)上調(diào)具有時間依賴性,感染后6hIFN λ1 mRNA表達(dá)開始上調(diào)(HT29上調(diào)11.54倍,HCT1164.96倍),感染后12 h IFN λ1 mRNA上調(diào)表達(dá)最高(HT29上調(diào)82.56倍,HCT11643.41倍),感染后24 h IFN λ1 mRNA上調(diào)表達(dá)又有所降低(HT29上調(diào)66.76倍,HCT11622.83倍)。使用不同滴度(0.01 TCID50/cell、0.1 TCID50/cell、1TCID50/cell的輪狀病毒CC0812-1株分別感染腸上皮細(xì)胞系HT29和HCT116,感染后12h提取細(xì)胞總RNA,通過qRT-PCR檢測IFN λ1 mRNA的表達(dá)水平,結(jié)果顯示輪狀病毒引起的IFN λ1 mRNA上調(diào)表達(dá)具有病毒滴度依賴性,隨著病毒感染滴度的增加,IFN λ1 mRNA上調(diào)表達(dá)水平亦逐漸增加,滴度為0.01 TCID50/cell病毒誘導(dǎo)HT29和HCT116細(xì)胞中IFN λ1 mRNA分別上調(diào)表達(dá)2.03倍和2.02倍,滴度為0.1 TCID50/cell病毒誘導(dǎo)HT29和HCT116細(xì)胞中IFN λ1 mRNA分別上調(diào)表達(dá)10.29倍和11.59倍,滴度為1 TCID50/cell病毒誘導(dǎo)HT29和HCT116細(xì)胞中IFN λ1 mRNA分別上調(diào)表達(dá)82.56倍和43.41倍。與此同時,選擇滴度為1TCID50/cell的輪狀病毒感染12 h后,qRT-PCR檢測顯示細(xì)胞內(nèi)識別外源dsRNA的模式識別受體RIG-I與MDA5和幾種重要的IRF(IRF1、 IRF3、IRF7、IRF9)均顯著上調(diào)表達(dá),感染的HT29細(xì)胞中RIG-I、MDA5、IRF1、 IRF3、IRF7、IRF9 mRNA分別上調(diào)表達(dá)5.3、5.67、4.96、1.72、3.61和1.50倍,感染的HCT116細(xì)胞中RIG-I、MDA5、IRF1、IRF3、IRF7、IRF9 mRNA分別上調(diào)表達(dá)2.35、2.20、2.32、1.49、2.52和1.64倍。通過RIG-I siRNA、MDA5 siRNA單獨(dú)干擾的HCT116細(xì)胞、RIG-I siRNA和MDA5 siRNA同時干擾的HCT116細(xì)胞與正常組細(xì)胞感染病毒12h后相比其IFN λ1 mRNA表達(dá)依次為后者的0.37、0.73與0.27倍。結(jié)果表明干擾HCT116細(xì)胞內(nèi)RIG-I與MDA5后輪狀病毒感染誘導(dǎo)的IFN λ1 mRNA上調(diào)表達(dá)受到抑制,由此我們初步推斷,宿主細(xì)胞主要通過RIG-I/MDA5識別輪狀病毒感染,且激活下游信號通路引起IFN λ1表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：輪狀病毒感染 腸上皮細(xì)胞 固有免疫 轉(zhuǎn)錄組測序 IFNλ1表達(dá) 信號通路
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第1章 文章綜述13-26
• 1.1 輪狀病毒簡述13-19
• 1.1.1 發(fā)現(xiàn)13
• 1.1.2 輪狀病毒分類與結(jié)構(gòu)13-14
• 1.1.3 輪狀病毒復(fù)制周期14-16
• 1.1.4 輪狀病毒傳播途徑與致病機(jī)制16-17
• 1.1.5 輪狀病毒免疫17-19
• 1.2 高通量轉(zhuǎn)錄組測序19-25
• 1.2.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)概述19-20
• 1.2.2 第二代測序技術(shù)20-24
• 1.2.3 RNA-Seq在病毒與宿主相互作用研究中的應(yīng)用24-25
• 1.3 本課題研究思路25-26
• 第2章 轉(zhuǎn)錄組測序揭示抗輪狀病毒相關(guān)免疫基因26-56
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料26-28
• 2.1.1 細(xì)胞系26
• 2.1.2 病毒株26
• 2.1.3 主要試劑26
• 2.1.4 細(xì)胞培養(yǎng)液26-27
• 2.1.5 主要儀器與耗材27-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-35
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、凍存與復(fù)蘇28
• 2.2.2 輪狀病毒增殖28-29
• 2.2.3 輪狀病毒滴度測定29-30
• 2.2.4 輪狀病毒感染HT29細(xì)胞30
• 2.2.5 細(xì)胞總RNA提取30
• 2.2.6 細(xì)胞總RNA質(zhì)量檢測30-31
• 2.2.7 測序文庫構(gòu)建31
• 2.2.8 文庫質(zhì)控與測序31
• 2.2.9 測序數(shù)據(jù)處理31-32
• 2.2.10 與參考基因組比對分析32-33
• 2.2.11 實(shí)時熒光定量PCR鑒定RNA-Seq的準(zhǔn)確性33-35
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-52
• 2.3.1 輪狀病毒細(xì)胞病變效應(yīng)35-36
• 2.3.2 病毒效價36-37
• 2.3.3 細(xì)胞總RNA提取37
• 2.3.4 細(xì)胞總RNA樣品質(zhì)量檢測37-38
• 2.3.5 測序數(shù)據(jù)及質(zhì)量分析38-39
• 2.3.6 對統(tǒng)計(jì)39
• 2.3.7 轉(zhuǎn)錄組文庫質(zhì)量評估39-41
• 2.3.8 基因表達(dá)定量分析41-43
• 2.3.9 基因差異表達(dá)分析43-47
• 2.3.10 免疫相關(guān)基因差異表達(dá)47-51
• 2.3.11 熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果51-52
• 2.4 討論52-56
• 2.4.1 RNA-seq數(shù)據(jù)質(zhì)量與可靠性52-53
• 2.4.2 輪狀病毒感染前后宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組變化討論53-56
• 第3章 RV誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生IFNλ1的機(jī)制初步探究56-65
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料56
• 3.1.1 細(xì)胞系56
• 3.1.2 病毒株56
• 3.1.3 主要試劑56
• 3.1.4 主要儀器設(shè)備56
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法56-58
• 3.2.1 輪狀病毒感染HT29與HCT116細(xì)胞系56-57
• 3.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞57
• 3.2.3 RNA提取、cDNA合成及qRT-PCR檢測mRNA表達(dá)水平57
• 3.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析57-58
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果58-62
• 3.3.1 RV誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞IFNλ1上調(diào)表達(dá)58-59
• 3.3.2 RV誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞dsRNA受體RIG-I/MDA 5 mRNA上調(diào)表達(dá)59-60
• 3.3.3 RV誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞IRF mRNA上調(diào)表達(dá)60-61
• 3.3.4 RIG-I/MDA5信號通路激活I(lǐng)FNλ1表達(dá)61-62
• 3.4 討論62-65
• 參考文獻(xiàn)65-72
• 英文縮寫表72-73
• 碩士期間發(fā)表的論文73-74
• 致謝74

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2 徐瑞;何振娟;施君;周一s，

本文編號：664080