本文關鍵詞：抗IL-13全人源單鏈抗體的篩選、可溶性表達及鑒定

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【摘要】：目的:上世紀80年代,隨著DNA重組技術的成熟,將其廣泛應用于分子生物學和抗體基因結(jié)構的改造�？贵w制備技術已從多克隆抗體、單克隆抗體發(fā)展到基因工程抗體。隨著噬菌體展示技術、酵母展示技術等的出現(xiàn)大大提高了抗體的制備�；蚬こ炭贵w又經(jīng)歷了Fab抗體、sc Fv抗體、全人源抗體等,其具有穿透性強,分子量小,便于操作,不與Fc受體結(jié)合等特點,成為基因工程抗體研究熱點。近年來,隨著深入的研究,體外篩選技術成為篩選全人源抗體的主要方式。支氣管哮喘是一種與遺傳和環(huán)境密切相關的疾病,在過去幾十年里,支氣管哮喘發(fā)作在發(fā)達國家中逐年上升的趨勢。相比之下,遺傳因素一定在這樣一個相對較短的時間不變。雖然數(shù)百研究員列出了幾個潛在的遺傳因素可能影響疾病易感性,但沒有成功的嘗試針對任何特定的基因因素來治療支氣管哮喘。根據(jù)哮喘的發(fā)病機制從基礎分子免疫學、分子病理生理學的新發(fā)現(xiàn)去針對性的研制依從性較好、副作用少,可以改善患者病癥的藥物。無論是在小鼠和人上,細胞因子在哮喘的病理生理學非常重要,提出了一種抑制Th2等細胞因子如白介素(IL)-4,IL-5,和IL-13可能是一個合理的治療哮喘方法。其中IL-13主要由CD4+Th2細胞和2型固有淋巴細胞(ILC2)分泌,IL-13誘導B淋巴細胞合成大量的Ig E抗體,同時增加嗜酸性粒細胞的募集,引起氣道上皮細胞表達i NOS,黏液產(chǎn)生和杯狀細胞增生,刺激氣道平滑肌收縮,提高細胞外膠原蛋白和纖維母細胞向成肌纖維細胞表型轉(zhuǎn)變等,IL-13通過IL-13Rα1與IL-4R形成受體復合物,參與信號轉(zhuǎn)導,激活靶基因轉(zhuǎn)錄,誘導TH0細胞分化、氣道炎癥、氣道高反應、黏液產(chǎn)生。因此,IL-13在哮喘氣道炎癥和重塑有顯著的影響[1,2]。本實驗將從前期構建的天然全人源抗體文庫中篩選特異性好、有體外中和活性的抗IL-13單鏈抗體,為后期構建抗IL-4/IL-13雙特異性抗體及研制治療過敏性哮喘的抗體藥物奠定基礎。方法:構建IL-13 c DNA/p ET101/D-TOPO表達載體,轉(zhuǎn)化到BL21表達菌體中,通過IPTG誘導表達蛋白,并進行純化和鑒定。以生物素化IL-13蛋白為抗原,對前期構建的天然抗體文庫利用噬菌體展示技術進行3輪富集,在富集的單鏈抗體文庫中用ELISA篩選抗IL-13全人源單鏈抗體(sc Fv)。用Bst NI酶切方法對篩選抗IL-13-sc Fv陽性克隆子進行指紋圖分析,將指紋圖譜不同的克隆子送去測序。結(jié)果顯示在單鏈抗體氨基酸序列中出現(xiàn)了琥珀終止密碼子,位于第32位氨基酸處。將琥珀密碼子進行校正,利用單點突變的方法突變終止密碼子中的一對堿基后變?yōu)榘被酺rp(W)。將校正后的基因雙酶切后連接LZ16載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a F,后進行表達純化,用Dot Blot及Western Blot方法對表達純化的抗IL-13-sc Fv蛋白進行鑒定;用競爭ELISA方法檢測sc Fv和IL-13受體(IL-13Rα1)的競爭結(jié)合,分析sc Fv和IL-13受體(IL-13Rα1)是否作用于IL-13的同一抗原表位。從而達到封阻IL-13與受體結(jié)合的功能。用大分子相互作用分析技術對抗IL-13全人源單鏈抗體進行親和力分析。結(jié)果:(1)IL-13抗原的表達純化及鑒定:將擴增大小為700bp左右的c DNA與p ET101/D-TOPO連接,轉(zhuǎn)化到表達菌株BL21進行包涵體表達,表達的蛋白分子量大小為29KDa左右,經(jīng)Dot Blot及Western Blot鑒定表明有顯色且條帶唯一,則為IL-13抗原蛋白。(2)抗IL-13全人源單鏈抗體篩選與表達:以生物素化IL-13蛋白為抗原,對前期構建的天然抗體文庫利用噬菌體展示技術進行3輪富集,通過ELISA檢測有30%的sc Fv與IL-13有結(jié)合性;將得到的陽性克隆子與IL-4,TSLP通過ELISA檢測特異性,結(jié)果顯示有一些單克隆子與IL-4,TSLP不結(jié)合,即不顯色,說明此單克隆子有較好的特異性,與其他細胞因子交叉反應較低。挑選14個OD值較高的抗IL-13-sc Fv陽性克隆子進行PCR擴增,用Bst NI酶切方法對其進行指紋圖分析,將指紋圖譜不同的克隆子送去測序。結(jié)果顯示在單鏈抗體氨基酸序列中出現(xiàn)了琥珀終止密碼子,位于第32位氨基酸處。對琥珀密碼子進行校正,利用單點突變的方法突變終止密碼子中的一對堿基后變?yōu)榘被酺rp(W)。將校正后的基因雙酶切后與原核分泌性表達載體LZ16連接,構建重組表達載體IL-13-sc Fv/LZ16,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5αF,進行測序,測序正確后進行蛋白表達和純化。對單鏈抗體進行表達及純化,結(jié)果顯示sc Fv在大腸桿菌DH5αF,中主要集中分泌在細胞周質(zhì)間可溶性表達,抗體具備生物學活性,SDS-PAGE電泳顯示純化后的抗IL-13-sc Fv蛋白分子量大小為26KDa左右。(3)抗IL-13全人源單鏈抗體特性分析:Western Blot結(jié)果表明有顯色,且條帶唯一,即純化得到的蛋白為抗IL-13-sc Fv。競爭ELISA結(jié)果顯示:IL-13Rα1和篩選的單鏈抗體可競爭性的與IL-13結(jié)合,說明IL-13Rα1與單鏈抗體作用于IL-13的相同抗原表位,可有效的封阻IL-13/IL-13Rα1的信號通路具有生物學功能。大分子相互作用實驗(Blitz)結(jié)果顯示抗IL-13全人源單鏈抗體與相應抗原IL-13反應較好且得到親和力KD值為10-7,可見篩選得到抗IL-13全人源單鏈抗體有較好親和力;結(jié)論:成功篩選到具有體外中和活性、親和力相對較高、特異性較好的抗IL-13單鏈抗體。
【關鍵詞】：IL-13 全人源單鏈抗體 噬菌體展示
【學位授予單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392.11
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-12
• 材料與方法12-32
• 1 實驗材料12
• 2 主要實驗試劑12-15
• 3 主要實驗儀器15-17
• 4 實驗方法17-32
• 4.1 技術路線17-18
• 4.2 IL-13抗原的表達及純化18-22
• 4.3 抗IL-13全人源單鏈抗體的篩選與表達22-32
• 結(jié)果32-40
• 討論40-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻44-49
• 英漢縮略詞對照表49-50
• 致謝50-51
• IL-13與過敏性疾病的研究進展(綜述)51-73
• 參考文獻59-73

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1 王慧,蔭俊,侯曉軍,邢洪光;抗肉毒毒素A人源單鏈抗體在酵母細胞中的分泌表達[J];微生物學通報;2005年02期

2 霍銳;石毅;魏景艷;徐俊杰;呂紹武;閆飛;蘇家明;段玉晶;王詩雯;叢登立;李唯;閆崗林;羅貴民;;具有谷胱甘肽過氧化物酶活性的含硒人源單鏈抗體的制備[J];高等學�；瘜W學報;2008年07期

3 鐘彥偉,成軍,劉妍,董菁,楊繼珍,張玲霞;丙型肝炎病毒非結(jié)構蛋白3人源單鏈抗體的篩選與鑒定[J];中華傳染病雜志;2000年02期

4 段金柱,齊財,韓偉,王戰(zhàn)會,靳剛,閻錫蘊;抗SARS人源單鏈抗體H12的表達及復性[J];生物工程學報;2005年05期

5 何紅霞,貌盼勇,朱雷,侯俊,洪世雯,閻錫蘊;抗人免疫缺陷病毒1型gp120人源單鏈抗體的表達[J];中華實驗和臨床病毒學雜志;1998年03期

6 王慧,史晶,孟露露,李佩真,白瑜,蔭俊;抗A型肉毒毒素人源單鏈抗體融合蛋白的重組設計[J];微生物學通報;2005年04期

7 王曉娜;米志強;安小平;李建彬;范華昊;張文慧;張博;黃勇;周麗君;童貽剛;;從大容量噬菌體抗體庫中篩選抗Acr蛋白人源單鏈抗體[J];中國生物工程雜志;2012年09期

8 ;[J];;年期

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1 王媚娘;王天時;徐洪亮;武艷;李兵直;王文涵;李桂英;;抗CDK4人源單鏈抗體的作用機制研究[A];中國的遺傳學研究——遺傳學進步推動中國西部經(jīng)濟與社會發(fā)展——2011年中國遺傳學會大會論文摘要匯編[C];2011年

2 許晶晶;王磊;王琪;馮晶;曹玉華;陳勇;楊丹;李桂英;;抗CDK4人源單鏈抗體的原核表達、純化及活性分析[A];中國遺傳學會第八次代表大會暨學術討論會論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

3 童貽剛;;從大容量噬菌體抗體庫中篩選抗Acr蛋白人源單鏈抗體[A];2012全國臨床微生物與感染免疫學術研討會論文集[C];2012年

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1 張登梅;抗IL-13全人源單鏈抗體的篩選、可溶性表達及鑒定[D];西南醫(yī)科大學;2016年

2 許晶晶;抗CDK4人源單鏈抗體的原核表達、純化及活性分析[D];吉林大學;2009年

3 朱建光;抗胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素（TSLP）全人源單鏈抗體的篩選及特性分析[D];四川醫(yī)科大學;2015年

4 王媚娘;抗CDK4人源單鏈抗體作用機制的研究[D];吉林大學;2011年

5 曹玉華;抗cyclin D1人源單鏈抗體AD9的原核表達、純化及活性研究[D];吉林大學;2008年

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本文編號：642004