本文關(guān)鍵詞：抗IL-13全人源單鏈抗體的篩選、可溶性表達(dá)及鑒定

  更多相關(guān)文章： IL-13 全人源單鏈抗體 噬菌體展示

【摘要】：目的:上世紀(jì)80年代,隨著DNA重組技術(shù)的成熟,將其廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和抗體基因結(jié)構(gòu)的改造�？贵w制備技術(shù)已從多克隆抗體、單克隆抗體發(fā)展到基因工程抗體。隨著噬菌體展示技術(shù)、酵母展示技術(shù)等的出現(xiàn)大大提高了抗體的制備�；蚬こ炭贵w又經(jīng)歷了Fab抗體、sc Fv抗體、全人源抗體等,其具有穿透性強(qiáng),分子量小,便于操作,不與Fc受體結(jié)合等特點(diǎn),成為基因工程抗體研究熱點(diǎn)。近年來(lái),隨著深入的研究,體外篩選技術(shù)成為篩選全人源抗體的主要方式。支氣管哮喘是一種與遺傳和環(huán)境密切相關(guān)的疾病,在過(guò)去幾十年里,支氣管哮喘發(fā)作在發(fā)達(dá)國(guó)家中逐年上升的趨勢(shì)。相比之下,遺傳因素一定在這樣一個(gè)相對(duì)較短的時(shí)間不變。雖然數(shù)百研究員列出了幾個(gè)潛在的遺傳因素可能影響疾病易感性,但沒(méi)有成功的嘗試針對(duì)任何特定的基因因素來(lái)治療支氣管哮喘。根據(jù)哮喘的發(fā)病機(jī)制從基礎(chǔ)分子免疫學(xué)、分子病理生理學(xué)的新發(fā)現(xiàn)去針對(duì)性的研制依從性較好、副作用少,可以改善患者病癥的藥物。無(wú)論是在小鼠和人上,細(xì)胞因子在哮喘的病理生理學(xué)非常重要,提出了一種抑制Th2等細(xì)胞因子如白介素(IL)-4,IL-5,和IL-13可能是一個(gè)合理的治療哮喘方法。其中IL-13主要由CD4+Th2細(xì)胞和2型固有淋巴細(xì)胞(ILC2)分泌,IL-13誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞合成大量的Ig E抗體,同時(shí)增加嗜酸性粒細(xì)胞的募集,引起氣道上皮細(xì)胞表達(dá)i NOS,黏液產(chǎn)生和杯狀細(xì)胞增生,刺激氣道平滑肌收縮,提高細(xì)胞外膠原蛋白和纖維母細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變等,IL-13通過(guò)IL-13Rα1與IL-4R形成受體復(fù)合物,參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),激活靶基因轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)TH0細(xì)胞分化、氣道炎癥、氣道高反應(yīng)、黏液產(chǎn)生。因此,IL-13在哮喘氣道炎癥和重塑有顯著的影響[1,2]。本實(shí)驗(yàn)將從前期構(gòu)建的天然全人源抗體文庫(kù)中篩選特異性好、有體外中和活性的抗IL-13單鏈抗體,為后期構(gòu)建抗IL-4/IL-13雙特異性抗體及研制治療過(guò)敏性哮喘的抗體藥物奠定基礎(chǔ)。方法:構(gòu)建IL-13 c DNA/p ET101/D-TOPO表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)菌體中,通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,并進(jìn)行純化和鑒定。以生物素化IL-13蛋白為抗原,對(duì)前期構(gòu)建的天然抗體文庫(kù)利用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行3輪富集,在富集的單鏈抗體文庫(kù)中用ELISA篩選抗IL-13全人源單鏈抗體(sc Fv)。用Bst NI酶切方法對(duì)篩選抗IL-13-sc Fv陽(yáng)性克隆子進(jìn)行指紋圖分析,將指紋圖譜不同的克隆子送去測(cè)序。結(jié)果顯示在單鏈抗體氨基酸序列中出現(xiàn)了琥珀終止密碼子,位于第32位氨基酸處。將琥珀密碼子進(jìn)行校正,利用單點(diǎn)突變的方法突變終止密碼子中的一對(duì)堿基后變?yōu)榘被酺rp(W)。將校正后的基因雙酶切后連接LZ16載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a F,后進(jìn)行表達(dá)純化,用Dot Blot及Western Blot方法對(duì)表達(dá)純化的抗IL-13-sc Fv蛋白進(jìn)行鑒定;用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)sc Fv和IL-13受體(IL-13Rα1)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,分析sc Fv和IL-13受體(IL-13Rα1)是否作用于IL-13的同一抗原表位。從而達(dá)到封阻IL-13與受體結(jié)合的功能。用大分子相互作用分析技術(shù)對(duì)抗IL-13全人源單鏈抗體進(jìn)行親和力分析。結(jié)果:(1)IL-13抗原的表達(dá)純化及鑒定:將擴(kuò)增大小為700bp左右的c DNA與p ET101/D-TOPO連接,轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21進(jìn)行包涵體表達(dá),表達(dá)的蛋白分子量大小為29KDa左右,經(jīng)Dot Blot及Western Blot鑒定表明有顯色且條帶唯一,則為IL-13抗原蛋白。(2)抗IL-13全人源單鏈抗體篩選與表達(dá):以生物素化IL-13蛋白為抗原,對(duì)前期構(gòu)建的天然抗體文庫(kù)利用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行3輪富集,通過(guò)ELISA檢測(cè)有30%的sc Fv與IL-13有結(jié)合性;將得到的陽(yáng)性克隆子與IL-4,TSLP通過(guò)ELISA檢測(cè)特異性,結(jié)果顯示有一些單克隆子與IL-4,TSLP不結(jié)合,即不顯色,說(shuō)明此單克隆子有較好的特異性,與其他細(xì)胞因子交叉反應(yīng)較低。挑選14個(gè)OD值較高的抗IL-13-sc Fv陽(yáng)性克隆子進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用Bst NI酶切方法對(duì)其進(jìn)行指紋圖分析,將指紋圖譜不同的克隆子送去測(cè)序。結(jié)果顯示在單鏈抗體氨基酸序列中出現(xiàn)了琥珀終止密碼子,位于第32位氨基酸處。對(duì)琥珀密碼子進(jìn)行校正,利用單點(diǎn)突變的方法突變終止密碼子中的一對(duì)堿基后變?yōu)榘被酺rp(W)。將校正后的基因雙酶切后與原核分泌性表達(dá)載體LZ16連接,構(gòu)建重組表達(dá)載體IL-13-sc Fv/LZ16,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5αF,進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序正確后進(jìn)行蛋白表達(dá)和純化。對(duì)單鏈抗體進(jìn)行表達(dá)及純化,結(jié)果顯示sc Fv在大腸桿菌DH5αF,中主要集中分泌在細(xì)胞周質(zhì)間可溶性表達(dá),抗體具備生物學(xué)活性,SDS-PAGE電泳顯示純化后的抗IL-13-sc Fv蛋白分子量大小為26KDa左右。(3)抗IL-13全人源單鏈抗體特性分析:Western Blot結(jié)果表明有顯色,且條帶唯一,即純化得到的蛋白為抗IL-13-sc Fv。競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果顯示:IL-13Rα1和篩選的單鏈抗體可競(jìng)爭(zhēng)性的與IL-13結(jié)合,說(shuō)明IL-13Rα1與單鏈抗體作用于IL-13的相同抗原表位,可有效的封阻IL-13/IL-13Rα1的信號(hào)通路具有生物學(xué)功能。大分子相互作用實(shí)驗(yàn)(Blitz)結(jié)果顯示抗IL-13全人源單鏈抗體與相應(yīng)抗原IL-13反應(yīng)較好且得到親和力KD值為10-7,可見(jiàn)篩選得到抗IL-13全人源單鏈抗體有較好親和力;結(jié)論:成功篩選到具有體外中和活性、親和力相對(duì)較高、特異性較好的抗IL-13單鏈抗體。
【關(guān)鍵詞】：IL-13 全人源單鏈抗體 噬菌體展示
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392.11
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-12
• 材料與方法12-32
• 1 實(shí)驗(yàn)材料12
• 2 主要實(shí)驗(yàn)試劑12-15
• 3 主要實(shí)驗(yàn)儀器15-17
• 4 實(shí)驗(yàn)方法17-32
• 4.1 技術(shù)路線17-18
• 4.2 IL-13抗原的表達(dá)及純化18-22
• 4.3 抗IL-13全人源單鏈抗體的篩選與表達(dá)22-32
• 結(jié)果32-40
• 討論40-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 英漢縮略詞對(duì)照表49-50
• 致謝50-51
• IL-13與過(guò)敏性疾病的研究進(jìn)展(綜述)51-73
• 參考文獻(xiàn)59-73

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 王慧,蔭俊,侯曉軍,邢洪光;抗肉毒毒素A人源單鏈抗體在酵母細(xì)胞中的分泌表達(dá)[J];微生物學(xué)通報(bào);2005年02期

2 霍銳;石毅;魏景艷;徐俊杰;呂紹武;閆飛;蘇家明;段玉晶;王詩(shī)雯;叢登立;李唯;閆崗林;羅貴民;;具有谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的含硒人源單鏈抗體的制備[J];高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報(bào);2008年07期

3 鐘彥偉,成軍,劉妍,董菁,楊繼珍,張玲霞;丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3人源單鏈抗體的篩選與鑒定[J];中華傳染病雜志;2000年02期

4 段金柱,齊財(cái),韓偉,王戰(zhàn)會(huì),靳剛,閻錫蘊(yùn);抗SARS人源單鏈抗體H12的表達(dá)及復(fù)性[J];生物工程學(xué)報(bào);2005年05期

5 何紅霞,貌盼勇,朱雷,侯俊,洪世雯,閻錫蘊(yùn);抗人免疫缺陷病毒1型gp120人源單鏈抗體的表達(dá)[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志;1998年03期

6 王慧,史晶,孟露露,李佩真,白瑜,蔭俊;抗A型肉毒毒素人源單鏈抗體融合蛋白的重組設(shè)計(jì)[J];微生物學(xué)通報(bào);2005年04期

7 王曉娜;米志強(qiáng);安小平;李建彬;范華昊;張文慧;張博;黃勇;周麗君;童貽剛;;從大容量噬菌體抗體庫(kù)中篩選抗Acr蛋白人源單鏈抗體[J];中國(guó)生物工程雜志;2012年09期

8 ;[J];;年期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 王媚娘;王天時(shí);徐洪亮;武艷;李兵直;王文涵;李桂英;;抗CDK4人源單鏈抗體的作用機(jī)制研究[A];中國(guó)的遺傳學(xué)研究——遺傳學(xué)進(jìn)步推動(dòng)中國(guó)西部經(jīng)濟(jì)與社會(huì)發(fā)展——2011年中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)大會(huì)論文摘要匯編[C];2011年

2 許晶晶;王磊;王琪;馮晶;曹玉華;陳勇;楊丹;李桂英;;抗CDK4人源單鏈抗體的原核表達(dá)、純化及活性分析[A];中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)第八次代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編（2004-2008）[C];2008年

3 童貽剛;;從大容量噬菌體抗體庫(kù)中篩選抗Acr蛋白人源單鏈抗體[A];2012全國(guó)臨床微生物與感染免疫學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 張登梅;抗IL-13全人源單鏈抗體的篩選、可溶性表達(dá)及鑒定[D];西南醫(yī)科大學(xué);2016年

2 許晶晶;抗CDK4人源單鏈抗體的原核表達(dá)、純化及活性分析[D];吉林大學(xué);2009年

3 朱建光;抗胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）全人源單鏈抗體的篩選及特性分析[D];四川醫(yī)科大學(xué);2015年

4 王媚娘;抗CDK4人源單鏈抗體作用機(jī)制的研究[D];吉林大學(xué);2011年

5 曹玉華;抗cyclin D1人源單鏈抗體AD9的原核表達(dá)、純化及活性研究[D];吉林大學(xué);2008年

，

本文編號(hào)：642004