本文關(guān)鍵詞：B7-1人—鼠嵌合抗體對(duì)Pristane誘導(dǎo)的小鼠狼瘡樣腎炎模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機(jī)制的研究

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【摘要】：B7-1(又稱CD80)分子是一種共刺激分子,主要表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)表面,其受體為T淋巴細(xì)胞表面CD28家族分子,二者結(jié)合后可介導(dǎo)T細(xì)胞活化、增殖與分化,從而發(fā)揮機(jī)體的免疫效應(yīng)。正常生理?xiàng)l件下B7-1分子表達(dá)穩(wěn)定,為T細(xì)胞的活化提供協(xié)同刺激信號(hào),維持T細(xì)胞的存活。當(dāng)B7-1不表達(dá)或低表達(dá)的時(shí)候,將會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞的功能異常,致使T細(xì)胞無能或凋亡,導(dǎo)致機(jī)體患病。反之B7-1高表達(dá)又會(huì)使T細(xì)胞過度活化,引起自身免疫性疾病。自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID)是指機(jī)體對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病,主要表現(xiàn)為T、B淋巴細(xì)胞過度活化。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種常見的自身免疫病,其中狼瘡性腎炎又是SLE最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥,是導(dǎo)致SLE患者死亡的主要原因之一。大量研究表明,在SLE患者體內(nèi)B7-1分子的表達(dá)明顯高于正常人,提示B7-1/CD28協(xié)同刺激信號(hào)在SLE病理過程中發(fā)揮著重要作用。通過B7-1抗體封閉抗原提呈細(xì)胞表面的B7-1分子,從而阻斷B7-1/CD28信號(hào)通路,降低機(jī)體的免疫應(yīng)答。但傳統(tǒng)的單克隆抗體由于鼠源性高,易引起人抗鼠抗體反應(yīng)(human anti-mouse antibody response,HAMA),限制了其應(yīng)用。采用基因工程技術(shù)設(shè)計(jì)的嵌合抗體是一種人源化的重組抗體,它是應(yīng)用DNA重組技術(shù)將鼠源性單抗V區(qū)基因與人IgG的C區(qū)基因拼接后,插入適當(dāng)載體,轉(zhuǎn)染相應(yīng)宿主細(xì)胞表達(dá)的抗體分子。嵌合抗體包含了鼠源Fab段與人源Fc段,人源化部分達(dá)到70%,大大降低了HAMA反應(yīng),延長(zhǎng)了半衰期。此類抗體一方面具有鼠源性單抗Fab段高親和力結(jié)合抗原的能力,另一方面其人源Fc段在患者體內(nèi)又可介導(dǎo)ADCC效應(yīng)、CDC效應(yīng)及免疫調(diào)理作用。本課題在運(yùn)用化學(xué)法建立小鼠狼瘡樣腎炎模型并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上,運(yùn)用自行研制的B7-1人鼠嵌合抗體對(duì)模型小鼠進(jìn)行干預(yù),通過免疫學(xué)、血清學(xué)、病理學(xué)等指標(biāo),探討B(tài)7-1人鼠嵌合抗體阻斷B7-1/CD28信號(hào)通路對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎模型病理損傷的逆轉(zhuǎn)效應(yīng),以期尋找針對(duì)該類疾病更加高效、安全、給藥方便的抗體藥物。一、b7-1人鼠嵌合抗體的制備及鑒定目的:制備b7-1人鼠嵌合抗體并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。方法:將表達(dá)b7-1嵌合抗體的細(xì)胞株大規(guī)模培養(yǎng),收集上清;proteing親和層析分離純化抗體;流式細(xì)胞術(shù)分析嵌合抗體對(duì)人及小鼠細(xì)胞膜型b7-1分子的識(shí)別。結(jié)果:經(jīng)proteing親和層析柱分析純化,lowry法定量,所得的嵌合抗體蛋白濃度為2.5mg/l;b7-1人鼠嵌合抗體與轉(zhuǎn)人b7-1基因小鼠成纖維細(xì)胞株l929-b7-1、淋巴瘤細(xì)胞株daudi、小鼠脾臟細(xì)胞的識(shí)別率分別為95.1%,96.6%和51.7%。結(jié)論:b7-1人鼠嵌合抗體能夠特異性的識(shí)別細(xì)胞膜表面b7-1分子。二、化學(xué)法建立小鼠狼瘡樣腎炎模型并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定目的:在運(yùn)用化學(xué)法建立小鼠狼瘡樣腎炎模型,并通過免疫學(xué)、血清學(xué)、組織形態(tài)學(xué)等指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定。方法:取6周齡雌性c57bl/6j小鼠,隨機(jī)分為2組,模型組予一次性腹腔注射pristane0.5ml/只,空白對(duì)照組給予等體積的生理鹽水。每2周檢測(cè)一次血清中ana及抗dsdna抗體的滴度,每月定期檢測(cè)小鼠的尿蛋白含量,流式細(xì)胞術(shù)分析脾臟中抗原提呈細(xì)胞、漿細(xì)胞、t細(xì)胞的活化程度,經(jīng)he染色觀察腎臟的病理學(xué)改變,免疫組織化學(xué)分析腎臟免疫復(fù)合物的沉積,透射電鏡觀察腎小球及基底膜的改變。結(jié)果:pristane誘導(dǎo)后,部分小鼠出現(xiàn)尿蛋白,隨時(shí)間的延長(zhǎng),4個(gè)月時(shí)80%小鼠尿蛋白含量達(dá)到++~+++;2個(gè)月時(shí),小鼠血清中抗dsdna抗體陽性率為60%,ana陽性率為90%;流式分析結(jié)果顯示,模型組小鼠脾臟中吞噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、粒細(xì)胞的活化明顯升高(p0.05),b細(xì)胞膜表面cd21、cd80、cd86分子表達(dá)水平造模組明顯高于對(duì)照組(p0.05),模型組t細(xì)胞表面cd4、cd25、cd28、cd152分子表達(dá)明顯高于對(duì)照組(p0.05);腎臟he切片可見腎小球體積中重度增大,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及腎小管輕微充血,免疫熒光染色可見腎小球上有大量ic沉積;透射電鏡觀察腎小球致密物沉積明顯,基底膜嚴(yán)重增厚。結(jié)論:成功建立pristane誘導(dǎo)的小鼠狼瘡樣腎炎模型。三、b7-1人-鼠嵌合抗體對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機(jī)制的研究目的:探討b7-1人-鼠嵌合抗體阻斷b7/d28信號(hào)通路對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎模型病理損傷的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。方法:按上述方法建立小鼠狼瘡樣腎炎模型,取成模小鼠隨機(jī)分為3組,每組10只�？贵w干預(yù)組用b7-1人-鼠嵌合抗體經(jīng)眼眶后靜脈給藥,陽性對(duì)照組注射免疫抑制劑ctx,模型組注射人同型igg。每月定期檢測(cè)尿蛋白含量、血清中ANA及抗dsDNA抗體滴度,干預(yù)至3個(gè)月時(shí),處死小鼠,研磨脾臟經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析多種免疫相關(guān)細(xì)胞的活化,取腎臟進(jìn)行HE染色分析,免疫復(fù)合物(IC)檢測(cè)及透射電鏡觀察。結(jié)果:抗體干預(yù)后,尿蛋白濃度逐漸由++~+++降為±~++,同時(shí)血清中ANA和抗dsDNA抗體的熒光強(qiáng)度也明顯降低,與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。流式結(jié)果顯示,抗體干預(yù)組脾臟中吞噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、粒細(xì)胞的活化明顯低于模型組(P0.05),B細(xì)胞膜表面CD80、CD86分子表達(dá)水平模型組明顯高于抗體干預(yù)組(P0.05),T細(xì)胞表面CD4、CD25、CD152分子表達(dá)情況模型組高于抗體干預(yù)組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);腎臟HE染色結(jié)果顯示,抗體干預(yù)組腎小球炎性細(xì)胞侵潤(rùn)及腎小管充血等表現(xiàn)均得到明顯改善。免疫熒光染色可見抗體干預(yù)組抗原抗體復(fù)合物(IC)的熒光強(qiáng)度明顯減弱。經(jīng)透射電鏡觀察,抗體干預(yù)組與模型組相比,腎小球上的電子致密物沉積減少,基底膜厚度趨于均勻。結(jié)論:B7-1人鼠嵌合抗體通過抑制B7-1/CD28信號(hào)通路下調(diào)機(jī)體的免疫應(yīng)答,減少自身抗體的產(chǎn)生,對(duì)自身免疫造成的病理損傷具有逆轉(zhuǎn)作用。
【關(guān)鍵詞】：B7-1人-鼠嵌合抗體 降植烷 狼瘡樣腎炎 尿蛋白 抗雙鏈DNA抗體 抗核抗體
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R-332;R593.242
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 研究背景13-21
• 1.B7家族分子及其介導(dǎo)的協(xié)同刺激信號(hào)13-14
• 2.B7/CD28協(xié)同刺激信號(hào)在自身免疫疾病中的作用14
• 3.嵌合抗體在臨床疾病治療中的應(yīng)用14-15
• 4.系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）疾病的動(dòng)物模型15-17
• 參考文獻(xiàn)17-21
• 第一部分 B7-1 人鼠嵌合抗體的制備及鑒定21-26
• 材料和方法21-23
• 1.主要試劑與材料21-22
• 2.方法22-23
• 結(jié)果23
• 1.B7-1 人鼠嵌合抗體的的制備、純化及定量23
• 2.人鼠嵌合抗體對(duì)不同細(xì)胞膜型B7-1 分子的識(shí)別23
• 討論23-24
• 參考文獻(xiàn)24-26
• 第二部分 PRISTANE誘導(dǎo)的小鼠狼瘡樣腎炎模型的建立及生物學(xué)鑒定26-38
• 材料和方法26-31
• 1.材料26-27
• 2.方法27-31
• 結(jié)果31-35
• 1.小鼠尿蛋白的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)31
• 2.小鼠血清中ANA及抗dsDNA抗體的表達(dá)31-32
• 3.免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟細(xì)胞活化32-33
• 4.小鼠腎臟組織病理切片HE染色觀察33
• 5.小鼠腎臟組織免疫復(fù)合物（IC）熒光染色觀察33-34
• 6.透射電鏡對(duì)腎小球沉積物及基底膜改變的觀察34-35
• 討論35-36
• 參考文獻(xiàn)36-38
• 第三部分 B7-1 人-鼠嵌合抗體對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機(jī)制的研究38-52
• 材料和方法38-43
• 1.材料38-39
• 2.方法39-43
• 結(jié)果43-48
• 1.小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)觀察43
• 2.小鼠尿蛋白的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)43-44
• 3.小鼠血清ANA和抗dsDNA抗體的檢測(cè)44-45
• 4.免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟細(xì)胞活化45-46
• 5.小鼠腎臟組織病理切片HE染色觀察46-47
• 6.腎臟組織免疫復(fù)合物熒光染色觀察47
• 7.透射電鏡對(duì)腎小球沉積物及基底膜改變的觀察47-48
• 討論48-50
• 參考文獻(xiàn)50-52
• 全文小結(jié)52-53
• 綜述 基因工程抗體在治療自身免疫性疾病中的研究與展望53-61
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 中英文縮略詞表61-62
• 碩士研究生期間發(fā)表的論文62-63
• 本研究所獲得基金資助63-64
• 致謝64-65

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本文編號(hào)：608840