發(fā)布時(shí)間：2017-08-01 01:29

  本文關(guān)鍵詞：人血管內(nèi)皮鈣粘蛋白CDH5單克隆抗體的制備及其功能研究

  更多相關(guān)文章： CDH5 單克隆抗體制備 抗體功能 腫瘤監(jiān)測 肺癌

【摘要】：目的:本研究旨在應(yīng)用小鼠雜交瘤技術(shù)制備能夠識別人血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin,VECDH5),以下稱CDH5蛋白的單克隆抗體,探討CDH5在腫瘤組織中的表達(dá)及單抗的相關(guān)功能,并且進(jìn)一步研究CDH5與腫瘤新生血管的關(guān)系,為后續(xù)相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時(shí)建立檢測人血漿可溶性CDH5雙抗體夾心ELISA方法,為疾病的診斷及預(yù)后評估提供更好的臨床檢驗(yàn)方法。方法:采用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增CDH5胞外區(qū)基因片段,將該片段插入帶有His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體p ET-41a,誘導(dǎo)表達(dá),采用Ni-NTA柱親和純化CDH5重組蛋白,采用紫外分光光度計(jì)、SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色分析蛋白質(zhì)濃度和純度;利用經(jīng)典雜交瘤技術(shù)制備抗CDH5的單克隆抗體,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)、免疫熒光(Immunofluorescence)和免疫組化(Immunohistochemistry)方法驗(yàn)證單抗與CDH5的特異性結(jié)合能力;利用p ET-41a載體分段表達(dá)CDH5胞外區(qū),通過Western Blot初步確定單抗抗原表位所在區(qū)域,利用該區(qū)域合成肽進(jìn)行斑點(diǎn)印跡(Dot Blot)及競爭法ELISA進(jìn)一步分析單抗表位;所制備的單抗行免疫組化檢測CDH5在各種類型腫瘤標(biāo)本中的表達(dá);體外3DMatrigel血管形成實(shí)驗(yàn)探究CDH5單抗對腫瘤血管新生及血管生成擬態(tài)(Vascular mimicry,VM)的作用;細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)、CCK-8檢測單抗對細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖的影響;Western Blot檢測PI3K/AKT/β-catenin信號通路中相關(guān)蛋白的表達(dá);選取效價(jià)和親和力較高的幾株單抗,采用棋盤格滴定法篩選出最佳雙抗體組合,建立檢測人血漿可溶性CDH5雙抗體夾心ELISA方法,并進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)。結(jié)果:1.成功構(gòu)建了p ET-41a/CDH5-N-ter重組質(zhì)粒,誘導(dǎo)CDH5-His重組蛋白表達(dá),大小約70 k Da,與預(yù)期大小一致,經(jīng)純化后考馬斯亮藍(lán)染色顯示蛋白純度高,能用于免疫小鼠。2.雜交瘤細(xì)胞經(jīng)間接ELISA檢測成功篩選出一株功能性單抗2C11,抗體效價(jià)為1:8000。Western Blot、免疫熒光及免疫組化方法提示單抗2C11能夠特異性識別天然CDH5蛋白,且CDH5定位于內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞連接處并在黑色素瘤中存在表達(dá);為鑒定抗原表位,正確構(gòu)建了p ET41a/CDH5胞外區(qū)重組質(zhì)粒用于分段表達(dá)CDH5 N端蛋白,考馬斯亮藍(lán)染色顯示誘導(dǎo)細(xì)菌裂解后上清蛋白大小與預(yù)期一致,Western Blot顯示2C11能夠識別CDH5蛋白第351-456個(gè)氨基酸組成的蛋白,進(jìn)一步的Dot Blot法顯示2C11的抗原表位位于LDREVVPWYNLTVEA。3.免疫組化結(jié)果顯示,CDH5在人腎癌、腸癌和肺癌組織均有表達(dá);體外3DMatrigel血管形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)該單抗相較于陰性對照組具有抑制腫瘤血管形成的能力(P0.05);細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)說明該單抗相較于對照組具有降低細(xì)胞黏附能力的作用(P0.05);CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單抗2C11能抑制細(xì)胞增殖(P0.05);Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示P-AKT和β-catenin水平下降(P0.05)。4.與此同時(shí),通過篩查配對,選取4E6和9A6兩株單抗成功建立檢測人血漿可溶性CDH5的雙抗體夾心ELISA方法,該法的檢測限為24.7 pg/ml,批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為4.1%-7.7%,批間CV為8.7%-10.8%,平均回收率為96.7%。結(jié)論:(1)利用雜交瘤技術(shù)成功制備了一株效價(jià)高、特異性好的單克隆抗體2C11,可用于Western Blot、免疫熒光和免疫組化檢測CDH5的表達(dá)情況,并成功鑒定出抗原表位。(2)CDH5在腎癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤中均存在表達(dá),同時(shí)篩選出CDH5在肺腺癌細(xì)胞株中存在表達(dá),單抗2C11具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力。單抗的功能研究說明2C11在體外能抑制腫瘤血管生成。此過程涉及到VM的發(fā)生發(fā)展,相關(guān)蛋白分子表達(dá)水平的檢測提示CDH5作為VM發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié),影響細(xì)胞的增殖從而進(jìn)一步參與肺癌的發(fā)生發(fā)展過程。(3)建立的雙抗體夾心ELISA試劑盒有較好的靈敏度及特異性,可用于人血漿中可溶性CDH5含量的檢測,并可作為腫瘤診斷的一種新檢測手段。
【關(guān)鍵詞】：CDH5 單克隆抗體制備 抗體功能 腫瘤監(jiān)測 肺癌
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392.11
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 引言10-14
• 參考文獻(xiàn)11-14
• 材料與方法14-19
• 材料14-19
• 實(shí)驗(yàn)方法和步驟19-37
• 結(jié)果37-54
• 討論54-57
• 參考文獻(xiàn)57-60
• 綜述60-70
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文70-71
• 中英文縮寫詞表71-72
• 致謝72-73

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1 段薇,張健,鄭劍玲,蘇丹,王美慧;抗呼吸道合胞病毒單克隆抗體的研制[J];微生物學(xué)雜志;2004年05期

2 張唯敏;;新單克隆抗體已應(yīng)用于臨床[J];國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊);1986年04期

3 遲素敏;;單克隆抗體的制備和鑒定[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;1986年Z1期

4 張明杰;單克隆抗體在農(nóng)業(yè)中有何用途?[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;1991年02期

5 孫國鳳;;單克隆抗體藥品在日本通過調(diào)查會[J];生物技術(shù)通報(bào);1991年09期

6 ;一種制備單克隆抗體的更有效而經(jīng)濟(jì)的方法[J];國外醫(yī)學(xué)(臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊);1998年05期

7 任新玲,沈麗英,金伯泉,井曉梅,王睿;表皮生長因子受體單克隆抗體抗肺癌作用的研究[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年03期

8 章波,陳惠鵬,范國才,陳吉中,王清明;抗人肝再生增強(qiáng)因子單克隆抗體的研制[J];免疫學(xué)雜志;2000年06期

9 李鳳英,陳名道,顧衛(wèi)瓊,陳春榮,唐金鳳;人瘦素單克隆抗體的鑒定[J];放射免疫學(xué)雜志;2000年02期

10 陳志南,蔣建利;單克隆抗體——從鼠到人[J];國外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊);2000年03期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 徐爽;安萬新;胡榮花;葉萍;孟祥昱;;不同方法收集單克隆抗體濃縮后的比較[A];中國輸血1999年年會暨紀(jì)念A(yù)BO血型發(fā)現(xiàn)100周年學(xué)術(shù)交流論文專輯[C];1999年

2 劉大維;高斌;;狂犬病毒單克隆抗體的研制[A];2010年中國科學(xué)院微生物研究所博士后學(xué)術(shù)年會暨第二屆博誼論壇論文摘要集[C];2011年

3 陳炅;;治療性單克隆抗體的作用靶點(diǎn)及臨床應(yīng)用[A];2013年中國臨床藥學(xué)學(xué)術(shù)年會暨第九屆臨床藥師論壇論文集[C];2013年

4 徐爽;徐焱;;單克隆抗體在輸血領(lǐng)域的應(yīng)用探討[A];中國輸血1999年年會暨紀(jì)念A(yù)BO血型發(fā)現(xiàn)100周年學(xué)術(shù)交流論文專輯[C];1999年

5 彭虹;舒翠麗;劉永全;王華;高杰英;;抗人α4單克隆抗體的制備和鑒定[A];中國免疫學(xué)會第四屆學(xué)術(shù)大會會議議程及論文摘要集[C];2002年

6 祭芳;史建榮;陳正賢;徐劍宏;陸瓊嫻;;抗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇單克隆抗體的制備[A];中國植物病理學(xué)會2008年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2008年

7 張光波;董秋明;於葛華;李文香;張學(xué)光;;一株鼠抗人4-1BB單克隆抗體的研制及其生物學(xué)功能的鑒定[A];第六屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2008年

8 張錦超;楊金菊;吳瓊;李戩;陳勇;李輝;宋穎博;羅曉彤;任飛;高媛;杜雪梅;鞠艷芳;王兆卿;王京蘭;徐菡;柳曉蘭;崔玉芳;錢小紅;賀福初;高建恩;孫啟鴻;;高效鑒定單克隆抗體所識別未知抗原技術(shù)平臺的建立及應(yīng)用[A];中國蛋白質(zhì)組學(xué)第二屆學(xué)術(shù)大會論文摘要論文集[C];2004年

9 楊永昌;王北寧;賴春寧;黎燕;;抗血小板單克隆抗體重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá)[A];第五次全國中青年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

10 孫效;高新;尚明美;宋海峰;湯仲明;;抗胰高血糖素樣肽單克隆抗體的制備[A];第八次全國藥物與化學(xué)異物代謝學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2006年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 記者 尹暉;單克隆抗體研發(fā)進(jìn)入新階段[N];無錫日報(bào);2010年

2 編譯 李勇;單克隆抗體：生物類似藥開發(fā)的秘鑰[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2014年

3 廣凱;單克隆抗體藥物將有大發(fā)展[N];中國醫(yī)藥報(bào);2000年

4 ;單克隆抗體應(yīng)用前景看好[N];中國醫(yī)藥報(bào);2002年

5 黃東臨;羅氏叱咤單克隆抗體市場[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2005年

6 ;單克隆抗體異軍突起[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2003年

7 尹暉;全球最大單克隆抗體研制基地落戶無錫[N];中國醫(yī)藥報(bào);2010年

8 尹暉;最大單克隆抗體研制項(xiàng)目在馬山奠基[N];無錫日報(bào);2010年

9 數(shù)文;羅氏買進(jìn)抗癌單克隆抗體[N];中國醫(yī)藥報(bào);2008年

10 毛文波;單克隆抗體：征服癌癥的新方法[N];科技日報(bào);2004年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 魏德強(qiáng);以植物病毒為載體建立新型的載體—半抗原免疫體系[D];東北林業(yè)大學(xué);2014年

2 王璞;以CD146為靶點(diǎn)的胃癌早期診斷多功能納米探針的相關(guān)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 張瀟;抗EV71病毒單克隆抗體及柯薩奇病毒病毒樣顆粒的制備研究[D];北京工業(yè)大學(xué);2015年

4 鄒年莉;雞傳染性支氣管炎病毒Sczy3 S1蛋白中和性單克隆抗體的制備及其抗原表位的鑒定[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 程林;人△42PD1特異性單克隆抗體的制備及其免疫功能的初步探討[D];南京大學(xué);2014年

6 王海;直腸癌上調(diào)表達(dá)蛋白eEF2單克隆抗體制備及臨床應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2016年

7 孫佳善;禽流感、新城疫和犬瘟熱病毒單克隆抗體篩選策略比較及應(yīng)用研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

8 胡新韜;HIV-1B'和CRF07_BC慢性感染者中和抗體應(yīng)答特征及CD4bs抗原特異性單克隆抗體分離鑒定初步研究[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2012年

9 白宇;馬γ-干擾素單克隆抗體的制備及細(xì)胞免疫評價(jià)方法的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2008年

10 余自強(qiáng);抗血小板膠原受體糖蛋白VI單克隆抗體的制備和功能研究[D];蘇州大學(xué);2005年

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1 王曉磊;流行性乙型腦炎病毒單克隆抗體的制備與prM-E蛋白抗原捕獲ELISA檢測方法的建立[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

2 葛新杰;NT-proBNP單克隆抗體的研制及ELISA定量檢測方法的建立[D];鄭州大學(xué);2015年

3 奉彬;基于鴨疫里炠氏桿菌表面抗原D15的乳膠凝集試驗(yàn)方法建立及其單克隆抗體的制備[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

4 李劍;抗TRPM2兔單克隆抗體制備及初步鑒定[D];浙江大學(xué);2016年

5 劉偉;胰腺炎型鴨1型甲肝病毒VP1蛋白單克隆抗體的制備[D];福建農(nóng)林大學(xué);2015年

6 俞錦錦;抗伏馬菌素B_1單克隆抗體的制備及其ELISA檢測試劑盒的研發(fā)[D];福建農(nóng)林大學(xué);2013年

7 郭淑音;一種小型切向流過濾器的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證及切向流過濾器縮小/放大理論[D];華東理工大學(xué);2016年

8 應(yīng)蘭;豬白細(xì)胞介素22克隆表達(dá)和活性研究及單克隆抗體的制備[D];青海大學(xué);2016年

9 宋革;馬鈴薯S病毒和馬鈴薯Y病毒單克隆抗體的制備及應(yīng)用[D];浙江大學(xué);2016年

10 彭言峰;牛血紅蛋白單克隆抗體的制備及其檢測試劑盒研制[D];吉林大學(xué);2016年

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本文編號：601989