本文關(guān)鍵詞：蛋白酶體亞單位（PSMB1）與蚊生殖的關(guān)系研究

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【摘要】：蚊媒病是危害人類健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題,蚊媒控制是蚊媒病防治的主要手段,化學(xué)殺蟲(chóng)劑的使用導(dǎo)致的蚊媒抗藥性加劇了蚊媒病的惡化趨勢(shì),研發(fā)可替代的新型殺蟲(chóng)劑是蚊媒防制研究的重點(diǎn)課題。采用抑制靶標(biāo)昆蟲(chóng)種群繁殖勢(shì)能的方法可以達(dá)到種群抑制的目的,因此深入研究雌蚊吸血和生殖產(chǎn)卵的分子機(jī)制,是有效控制蚊媒種群數(shù)量以及預(yù)防蚊媒病的重要措施。本研究以淡色庫(kù)蚊為研究對(duì)象,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),蛋白酶體亞單位(PSMB1)在蛹階段高表達(dá),分別是羽化后3d的雌雄蚊的28倍(*P0.05)和9.5倍(*P0.05),而在羽化后0h至7d的雌雄蚊體內(nèi)的表達(dá)水平立即下降,穩(wěn)定且趨于一致。Western blot檢測(cè)顯示,PSMB1蛋白在蛹階段不表達(dá),羽化后3d的雌蚊體內(nèi)開(kāi)始檢測(cè)到PSMB1,隨后表達(dá)量逐漸增加。不論在基因表達(dá)還是蛋白表達(dá),都提示我們PSMB1與蚊生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。根據(jù)PSMB1氨基酸序列預(yù)測(cè)的蛋白分子量大小約為24.88 KDa,Western blot實(shí)際檢測(cè)蛋白分子量大小約為35 KDa,經(jīng)去糖基化檢測(cè),顯示PSMB1存在部分糖基化修飾。隨后用Western blot進(jìn)行PSMB1體內(nèi)表達(dá)定位,發(fā)現(xiàn)PSMB1主要在蚊胸腹表達(dá),頭、足翅基本不表達(dá),說(shuō)明其分布具有組織特異性。其次,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)吸血后的雌蚊體內(nèi)組織特異性PSMB1的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)吸血后雌蚊PSMB1表達(dá)水平不斷上升,吸血后36h達(dá)到高峰,48h表達(dá)水平下降。我們利用RNA干擾技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證PSMB1是否參與蚊吸血產(chǎn)卵生理過(guò)程。用顯微注射方法敲低體內(nèi)PSMB1的表達(dá)水平(***P.001),我們首次發(fā)現(xiàn)PSMB1干擾后可以顯著降低雌蚊產(chǎn)卵率(***P0.001),顯著減少卵的數(shù)目(***P0.001)并顯著降低卵的孵化率(***P0.001),提示PSMB1干擾顯著影響雌蚊的生殖。解剖雌蚊卵巢發(fā)現(xiàn),未處理組卵巢邊緣整齊,PSMB1干擾組卵巢出現(xiàn)畸形,這可能是造成產(chǎn)卵率降低和卵數(shù)目減少的直接原因,且卵巢畸形可以影響后代的生存質(zhì)量。PSMB1干擾后,檢測(cè)其它蛋白酶體p亞單位的表達(dá)情況,PSMB2、PsMB3、PSMB6均有升高的現(xiàn)象(***P0.001,*P0.05),說(shuō)明PSMB1可能與其他蛋白酶體p亞單位協(xié)同調(diào)控雌蚊生殖這一生理過(guò)程。本課題首次發(fā)現(xiàn)蛋白酶體亞單位β6蛋白(PSMB1)在蚊幼蟲(chóng)期不表達(dá),僅在雌蚊羽化后開(kāi)始表達(dá),隨后表達(dá)量升高,且主要在腹部表達(dá)；抑制蛋白酶體催化亞單位表達(dá)似不影響雌蚊的吸血,但明顯降低雌蚊的產(chǎn)卵率、卵數(shù)目和孵化率,提示蛋白酶體在蚊生殖中發(fā)揮重要作用。以PSMB1為靶點(diǎn)抑制雌蚊生殖勢(shì)能,有望控制靶標(biāo)蚊種群數(shù)量。本研究的結(jié)果可望為研發(fā)基于直接控制雌蚊繁殖勢(shì)能的新型無(wú)污染生物殺蟲(chóng)劑奠定基礎(chǔ),為蚊媒綜合防制提供一種全新方法。
【關(guān)鍵詞】：蛋白酶體亞單位PSMB1 蚊 生殖
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R384.1
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-15
• 材料與方法15
• 一、材料15-17
• (一) 供試蚊15
• (二) 主要試劑15-16
• (三) 主要儀器設(shè)備16-17
• 二、方法17-32
• (一) 在mRNA水平上進(jìn)行驗(yàn)證17-21
• (二) 在蛋白水平上進(jìn)行驗(yàn)證21-25
• (三) LC-MS-MS聯(lián)用鑒定分析Western blot結(jié)果25-27
• (四) 糖基化分析27-28
• (五) Western blot檢測(cè)雌蚊各部位PSMB1的表達(dá)水平28
• (六) 功能驗(yàn)證28-32
• 結(jié)果32-43
• 一、PSMB1在蚊不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)32-33
• (一) 在mRNA水平上驗(yàn)證PSMB1在雌雄蚊不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)32-33
• (二) 在蛋白水平上驗(yàn)證PSMB1在雌雄蚊不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)33
• 二、液質(zhì)聯(lián)用鑒定分析Western blot結(jié)果33-34
• 三、糖基化分析34-35
• 四、Western blot檢測(cè)雌蚊各部位PSMB1的表達(dá)水平35
• 五、吸血前后雌蚊體內(nèi)PSMB1的表達(dá)變化35-36
• 六、PSMB1在雌蚊體內(nèi)的作用36-41
• 七、PSMB1影響雌蚊生殖的機(jī)制研究41-43
• 討論43-46
• 小結(jié)46-47
• 參考文獻(xiàn)47-54
• 綜述54-72
• 參考文獻(xiàn)64-72
• 致謝72

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