本文關(guān)鍵詞：SAMHD1蛋白的抗病毒功能研究

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【摘要】：SAMHD1是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的抗艾滋病毒的天然蛋白質(zhì)分子,在髓系來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和靜息CD4+T細(xì)胞中,發(fā)揮dNTPase功能,通過(guò)降低胞內(nèi)dNTP水平,阻止HIV-1病毒早期復(fù)制。此外,HIV-2和一些SIV編碼的Vpx蛋白,可以通過(guò)加載SAMHD1到CRL4DCAF1E3泛素連接酶上誘導(dǎo)SAMHD1蛋白酶體降解,通過(guò)降解SAMHD1促進(jìn)HIV-1反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA的積累,明顯促進(jìn)人的單核細(xì)胞及其來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的感染。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探索了恒河猴中不同SNP位點(diǎn)的SAMHD1蛋白的抗病毒功能、CEMx174細(xì)胞中SAMHD1蛋白表達(dá)與SIVmac239病毒水平的相關(guān)性以及SHIVsF162P3感染恒河猴體內(nèi)samhdl mRNA的變化等,以期進(jìn)一步完善對(duì)SAMHD1蛋白抗病毒功能的認(rèn)知。第一部分：不同SNP位點(diǎn)的SAMHD1蛋白的抗病毒功能的研究。前期在中國(guó)恒河猴中對(duì)SAMHD1蛋白進(jìn)行了大樣本篩查,共篩查出5個(gè)非同義cSNP位點(diǎn),均在群體中占有較高的頻率。其中G183S、E184D、V280A分布在具磷酸水解酶活性的HD結(jié)構(gòu)域上；S107L分布在參與蛋白-蛋白或蛋白-RNA相互作用的SAM結(jié)構(gòu)域上。用軟件對(duì)這5個(gè)SNP位點(diǎn)的SAMHD1二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和功能影響進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。發(fā)現(xiàn)了其中G183S、E184D、V280A這三個(gè)位點(diǎn)最有可能影響蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu),在二級(jí)結(jié)構(gòu)上,這三個(gè)位點(diǎn)所處的HD結(jié)構(gòu)域發(fā)生了一個(gè)cc螺旋到p片層的轉(zhuǎn)變,一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)也因?yàn)檫@三個(gè)cSNP的出現(xiàn)而發(fā)生了移位；在三級(jí)結(jié)構(gòu)上,V280A正好處于蛋白質(zhì)活性中心(凹槽部位)的袋口處,類(lèi)似于盒蓋的結(jié)構(gòu)上,可能會(huì)影響到SAMHD1的磷酸水解酶催化活性。S107L位于SAMHD1敏感性的位點(diǎn),可能影響病毒Vpx蛋白結(jié)合,說(shuō)明此位點(diǎn)也有較大可能會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。D5E未分布于重要的蛋白結(jié)構(gòu)域上,目前還沒(méi)有能改變蛋白功能的證據(jù)支持,但也有文獻(xiàn)報(bào)道,SAMHD1蛋白的N端能夠與艾滋病毒相互作用,所以有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究中,我們分別使用5種SNP位點(diǎn)突變的samhdl表達(dá)載體轉(zhuǎn)染TZM-bl細(xì)胞,再用轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞滴定HIV假病毒和SIV的病毒滴度,以驗(yàn)證5種SNP位點(diǎn)突變的SAMHD1蛋白抗病毒功能的大小。結(jié)果表明,不同SNP位點(diǎn)的SAMHD1蛋白的抗HIV病毒作用確實(shí)有些不同。其中,D5E、G183S、V280A三個(gè)位點(diǎn)突變的samhd質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)的samhd1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的的病毒滴定結(jié)果一致；S107L位點(diǎn)的突變使得TCID50的值比對(duì)照降低了10倍,發(fā)揮了比其他5個(gè)位點(diǎn)突變更高的抗病毒作用；E184D位點(diǎn)的突變,測(cè)出的TCID50的值比對(duì)照TZM-b1細(xì)胞的值高,說(shuō)明轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的基因可能沒(méi)有發(fā)揮抗病毒功能反而還影響了正常細(xì)胞內(nèi)的抗病毒蛋白發(fā)揮作用。與之相反,分別用轉(zhuǎn)染六種不同samhd1基因的TZM-b1細(xì)胞滴定SIVmac239病毒得到的TCID50的值都是一樣的。說(shuō)明不同SNP的SAMHD1蛋白抗SIVmac239的作用差異較小,對(duì)病毒的最終滴度影響不大。這應(yīng)該與SIVmac239編碼的Vpx蛋白有關(guān)。這也說(shuō)明,由于SIV病毒中Vpx蛋白的存在,SIV感染恒河猴不同個(gè)體間出現(xiàn)的疾病進(jìn)程的差異應(yīng)該與恒河猴體內(nèi)的SAMHD1蛋白沒(méi)有太大關(guān)系,更與SAMHD1蛋白的不同的SNP位點(diǎn)無(wú)關(guān)。第二部分：CEMx174細(xì)胞中SAMHD1蛋白表達(dá)與SIVmac239病毒水平的相關(guān)性研究。SAMHD1蛋白作為限制因子,在髓系樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和靜息CD礦T細(xì)胞中,發(fā)揮dNTPase功能,通過(guò)降低胞內(nèi)dNTP水平,阻止HIV-1病毒早期復(fù)制,但在感染的活化CD4+T細(xì)胞中,是否發(fā)揮抗病毒作用卻知之甚少。本研究中,CEMx174細(xì)胞感染SIVmac239病毒后,隨著培養(yǎng)上清中的病毒載量快速升高,細(xì)胞中病毒P27蛋白的表達(dá)水平也增加迅速。而samhd1的mRNA相對(duì)表達(dá)量在4天后顯著增加,與病毒載量呈正相關(guān),可見(jiàn)細(xì)胞在感染過(guò)程中,上調(diào)了samhd1基因的表達(dá)；與之相反的是細(xì)胞中SAMHD1蛋白表達(dá)量從4天后逐漸下降,第5-6天時(shí)基本檢測(cè)不到,與SIV病毒P27蛋白量呈顯著負(fù)相關(guān)。SAMHD1蛋白表達(dá)量的降低,可能與SIVmac239病毒產(chǎn)生的Vpx蛋白降解SAMHD1蛋白有關(guān)。SAMHD1蛋白在活化的細(xì)胞中是否發(fā)揮抗病毒的功能有待進(jìn)一步證實(shí),但本研究中發(fā)現(xiàn)感染SIV的CEMx174細(xì)胞samhd1基因上調(diào),蛋白含量下降,說(shuō)明SAMHD1在感染過(guò)程中是起作用的。廣譜表達(dá)的SAMHD1蛋白可能具有廣譜的抗病毒作用,不只是在靜息CD4+T細(xì)胞或髓系細(xì)胞中發(fā)揮作用。第三部分：SHIVsF162P3感染恒河猴體內(nèi)samhd1 mRNA表達(dá)量的變化。在SIV病毒感染的恒河猴研究中,Bianka Mubi1等人發(fā)現(xiàn),在緩慢進(jìn)展型疾病進(jìn)程中以及病毒載量水平較低的恒河猴體內(nèi),同SAMHD1同樣具有抗病毒作用的APOBEC3G(A3G)和APOBEC3F (A3F)蛋白在mRNA水平上表達(dá)量是增加的。那么, SAMHD1蛋白在SIV/SHIV感染猴體內(nèi),在mRNA水平上的表達(dá)量是否隨著病毒載量的變化也會(huì)有所變化?是否在恒河猴體內(nèi)發(fā)揮抗病毒的功能?本研究以SHIVSF162p3病毒靜脈感染4只中國(guó)恒河猴,均成功感染,其中一只表現(xiàn)出快速進(jìn)展型疾病特征。我們首先利用相對(duì)定量的方法檢測(cè)了感染恒河猴外周血PBMC細(xì)胞中的samhd1基因相對(duì)于內(nèi)參基因gapdh表達(dá)量的變化。發(fā)現(xiàn)除了快速進(jìn)展型的G0822V外,其余3只恒河猴的samhd1 mRNA水平均隨著病毒載量的升高而升高；快速進(jìn)展型的G0822V-P正好相反,伴隨著始終高水平的病毒載量,水平反而呈現(xiàn)向下波動(dòng)的趨勢(shì)。我們認(rèn)為,samhd1 mRNA表達(dá)量可能與疾病進(jìn)程相關(guān),快速進(jìn)展型及高水平病毒載量下調(diào)samhd1基因的表達(dá)。為了更直觀地顯示表達(dá)量的變化,本研究中我們還建立了用標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)samhd1基因mRNA水平的方法。研究中發(fā)現(xiàn),在感染急性期病毒載量增加的過(guò)程中,samhdl mRNA表達(dá)水平均略有下降,急性期后伴隨著載量的降低又恢復(fù)到正常水平。由此我們認(rèn)為,雖然SAMHD1是抗病毒蛋白分子,但在病毒感染的過(guò)程中,細(xì)胞可能下調(diào)了該類(lèi)蛋白的表達(dá)。至于下調(diào)的原因,是由于機(jī)體本身還是由于病毒感染導(dǎo)致的,機(jī)制尚不明確。另外,由于目前明確SAMHD1蛋白抗病毒功能的單核細(xì)胞、單核來(lái)源的巨噬細(xì)胞等同時(shí)也是SHIVSF162P3病毒攻擊的靶細(xì)胞,其感染后或死亡或被誘導(dǎo)凋亡,都會(huì)導(dǎo)致靶細(xì)胞數(shù)量的減少,從而導(dǎo)致檢測(cè)的mRNA水平的降低。
【關(guān)鍵詞】：SAMHD1 HIV SIV
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q51;R3411
【目錄】：

• 主要英文縮寫(xiě)詞4-5
• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 第一部分 不同SNP位點(diǎn)的恒河猴SAMHD1蛋白的抗病毒功能的研究14-46
• 第一節(jié) 引言14-15
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料15-21
• 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法21-34
• 第四節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-44
• 第五節(jié) 討論44-46
• 第二部分 CEMx174細(xì)胞中SAMHD1蛋白表達(dá)與SIVmac239病毒水平的相關(guān)性研究46-59
• 第一節(jié) 引言46-47
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料47-51
• 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法51-55
• 第四節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-58
• 第五節(jié) 討論58-59
• 第三部分 SHIV_(SF162P3)感染恒河猴外周血PBMC中samhd1 mRNA的變化59-75
• 第一節(jié) 引言59-60
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料60-63
• 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法63-68
• 第四節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果68-74
• 第五節(jié) 討論74-75
• 第四部分 總結(jié)75-77
• 參考文獻(xiàn)77-81
• 致謝81-83
• 個(gè)人基本情況83-84
• 碩士期間論文發(fā)表情況84-85

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 彭靈娟;SAMHD1蛋白的抗病毒功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2016年

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本文編號(hào)：576081