發(fā)布時(shí)間：2017-07-26 05:18

  本文關(guān)鍵詞：經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的生物學(xué)特性及多向分化潛能的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：目的現(xiàn)階段,用于研究干細(xì)胞的主要材料來源于胚胎干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,但這兩種來源的干細(xì)胞都存在著部分的局限性,例如涉及創(chuàng)傷性、倫理道德性等,所以現(xiàn)臨床急需要尋找一種新型的干細(xì)胞以避免上述干細(xì)胞標(biāo)本倫理學(xué)的爭議、來源的缺乏及腫瘤形成的潛在性等弊端。本實(shí)驗(yàn)主要研究來源于經(jīng)血的經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(menstrual blood-derived mesenchymal stem cells, MenSCs)在體外獲取及培養(yǎng)增殖的方法并鑒定,觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長情況等基本生物學(xué)特性以及體外誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞成脂細(xì)胞方向分化以及重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)體外誘導(dǎo)其向子宮內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細(xì)胞方向分化的可行性及不同濃度雌激素對(duì)分化結(jié)果的影響。為其在臨床中的應(yīng)用奠定一定基礎(chǔ)。方法本實(shí)驗(yàn)采用Ficoll密度梯度法從月經(jīng)第二天健康女性經(jīng)血中分離MenSCs,采用經(jīng)典的MTT法對(duì)體外擴(kuò)增的第一代、第二代細(xì)胞描繪生長曲線,并通過傳代培養(yǎng)、體外擴(kuò)增,使用倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及在培養(yǎng)過程中的動(dòng)態(tài)增殖變化。第二代細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測免疫表型的表達(dá)情況。取第二代MenSCs,分成誘導(dǎo)組和對(duì)照組。分別按5×104/mL接種至明膠包被的6孔板中,24小時(shí)細(xì)胞貼壁后。誘導(dǎo)組培養(yǎng)液更換成干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基+專用血清,成骨誘導(dǎo)液為：雙抗、200 μmol/L抗壞血酸、10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉和0.1 μ mol/L地塞米松。對(duì)照組培養(yǎng)液換為L-DMEM添加10%FBS,細(xì)胞置入37°C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每兩天換液1次,連續(xù)培養(yǎng)3周。分別在第1、2、3周結(jié)束誘導(dǎo)結(jié)束時(shí),通過檢測ALP活性、膠原表達(dá)情況、以及鈣結(jié)節(jié)表達(dá)情況,觀察成骨誘導(dǎo)的效果；分組方法同上,取第2代MenSCs,按5×104/mL接種于被明膠包被的6孔板中,細(xì)胞過夜貼壁后誘導(dǎo)組更換為干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基+專用血清,1×10-6 mol/L地塞米松,10 mol/L胰島素,0.5 mmol/L IBMX,0.2mmol/L吲哚美辛,對(duì)照組培養(yǎng)液L-DMEM添加10%F BS,細(xì)胞置入37。C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每兩天換液1次。分別在誘導(dǎo)2、3、4周結(jié)束時(shí),進(jìn)行油紅0染色,鏡下觀察油紅染色的結(jié)果。通過檢測MenSCs成骨成脂的誘導(dǎo)情況。探討其在體外向成骨成脂方向分化的潛能。將培養(yǎng)后的MenSCs分為4個(gè)研究組,每組培養(yǎng)體系中添加生長因子(TGF-β10ng/ml,EGF10ng/ml,PDGF-BB10ng/ml)和不同濃度17-β-雌二醇(1×10-9mol/L.1×10-8mol/L、1×10-7 mol/L.1×110-6mol/L),分別標(biāo)記為組1、組2、組3、組4,培養(yǎng)體系中未添加生長因子和雌激素的組為對(duì)照組。誘導(dǎo)培養(yǎng)5天后觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞標(biāo)記物角蛋白(cytokeratin,CK)和基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物波形蛋白(Vimentin,VIM),同時(shí)運(yùn)用RT-PCR和Westernblot檢測CK.VIM mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)的量,以進(jìn)一步驗(yàn)證MenSCs是否向子宮內(nèi)膜方向分化及不同雌激素濃度對(duì)分化過程的影響。結(jié)果本實(shí)驗(yàn)表明利用Ficoll離心法能從健康女性月經(jīng)血中分離并培養(yǎng)出干細(xì)胞,此原代細(xì)胞約1.5周達(dá)到85%-90%融合,細(xì)胞多成梭形、漩渦狀、輻射狀。MTT法得出細(xì)胞倍增時(shí)間約為30～32h。此細(xì)胞傳代后能穩(wěn)定生長,可見細(xì)胞形態(tài)以纖維樣為主導(dǎo)。發(fā)現(xiàn)傳代中,在接種細(xì)胞1～2天,細(xì)胞增殖緩慢,第3～4天全量換液后細(xì)胞生長迅速,進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,接著5-6天后細(xì)胞生長較前緩慢,進(jìn)入平臺(tái)期,整個(gè)過程未出現(xiàn)抑制現(xiàn)象。用流式細(xì)胞儀術(shù)檢測結(jié)果顯示,此類細(xì)胞表面標(biāo)記OCT-4、Strol-1、CD45、表達(dá)率分別為95.13%±0.81%,1.80%±0.92%,0.93%±0.42%。細(xì)胞表現(xiàn)出OCT-4強(qiáng)陽性,Strol-1、CD45陰性。此說明培養(yǎng)的細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞性質(zhì)。誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)表明MenSCs成骨誘導(dǎo)前期誘導(dǎo)組細(xì)胞膠原表達(dá)量較后期升高,MenSCs誘導(dǎo)兩周后經(jīng)茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)明顯,誘導(dǎo)組細(xì)胞ALP(alkaline phosphatase)活性-成骨細(xì)胞分化成熟的重要標(biāo)志隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長呈上升趨勢,強(qiáng)陽性,對(duì)照組陰性。經(jīng)成脂誘導(dǎo)3周,有明顯的脂滴出現(xiàn),油紅0染色呈陽性,對(duì)照組陰性。體外向子宮內(nèi)膜細(xì)胞方向分化結(jié)果表明：各研究組CK.VIM mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(p0.05)；組2(1×10-8mol/L)CK mRNA表達(dá)水平最高與其他4組相比較(p0.05,),且CK mRNA表達(dá)量隨雌激素濃度增高略有下降；而VIM的mRNA表達(dá)量相反,即隨著雌激素濃度增高VIM mRNA表達(dá)的量增加,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CK和VIM蛋白相對(duì)表達(dá)量也顯示這一結(jié)果。證實(shí)MenSCs在體外細(xì)胞生長因子和雌激素刺激下能夠向子宮內(nèi)膜細(xì)胞方向分化,且雌激素濃度不同分化結(jié)果有差異。結(jié)論通過Ficoll密度梯度離心法能獲得MenSCs,流式細(xì)胞術(shù)檢測特定的細(xì)胞表面標(biāo)志物也證實(shí)了其為經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細(xì)胞,進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)也表明其能在體外誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞方向分化。MenSCs在體外能夠誘導(dǎo)向子宮內(nèi)膜上皮和間質(zhì)細(xì)胞方向分化。生長因子和雌激素在此過程中起重要作用,并且不同濃度雌激素分化的效果影響不同。其具有較高的增殖能力、較低免疫原性、來源廣泛、多向分化潛能等特性,為經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞用于臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù),有望成為組織工程較為理想的種子細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】：經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細(xì)胞 多向分化 成骨誘導(dǎo) 成脂誘導(dǎo)
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 1 引言12-16
• 2 材料和方法16-27
• 3 結(jié)果27-37
• 4 討論37-41
• 5 結(jié)論41-42
• 6 參考文獻(xiàn)42-47
• 7 附錄47-48
• 8 致謝48-49
• 綜述49-56
• 參考文獻(xiàn)53-56

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張真真;桂濤;成臣;湯偉偉;曹鵬;萬貴平;;人子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定[J];江蘇醫(yī)藥;2014年09期

2 周云帆;楊波;胡祥;焦洪亮;周長輝;田毅;雷寧靜;谷晨熙;許予明;戴建武;關(guān)方霞;;經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2010年32期

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本文編號(hào)：574869