本文關(guān)鍵詞：FKBP52通過FOXA1調(diào)節(jié)雌激素受體ER和雄激素受體AR的平衡

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【摘要】：第一部分 FKBP52通過FOXA1調(diào)節(jié)雌激素受體ER和雄激素受體All的平衡[目的]ER與AR同屬于甾體激素受體超家族的成員,其平衡對(duì)生物體正常的生長發(fā)育過程至關(guān)重要。健康女性中ER和AR的表達(dá)量相當(dāng),而一些ER和AR失衡的組織內(nèi)疾病的發(fā)生率要顯著高于正常組織,說明其平衡在人體穩(wěn)態(tài)中的重要性。FKBP52是一種共伴侶蛋白通過參與形成激素受體復(fù)合物發(fā)揮功能。FKBP52敲除雄性小鼠存在乳腺發(fā)育的表型,前期研究發(fā)現(xiàn)FKBP52對(duì)ER/AR平衡產(chǎn)生影響,但具體的分子機(jī)制還缺乏了解。本課題通過對(duì)RNA-seq結(jié)果分析,結(jié)合免疫組化的結(jié)果,提出FKBP52可能通過FOXA1的影響ER與AR的平衡,并探究具體的分子機(jī)理。通過研究FKBP52基因敲除雄性小鼠乳腺發(fā)育的表型,對(duì)了解FOXA1在乳腺發(fā)育中及對(duì)ER和AR平衡的作用具有重要意義。[方法]1)表型分析及行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。測(cè)量突變雄鼠、野生雌鼠和野生雄鼠的腳趾第二指及第四指的長度并計(jì)算比值,以及觀察突變雄鼠行為學(xué)方面的改變。2)fRNA-seq測(cè)序。分離提取10天大小的突變雄鼠、野生雌鼠的乳頭和野生雄鼠相應(yīng)部位皮膚組織的RNA,測(cè)序篩選得到一些影響乳腺發(fā)育的基因；通過對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的分析找到可能影響乳腺發(fā)育的信號(hào)通路。3) Real-time PCR驗(yàn)證。將用作測(cè)序的同一批次的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過Real-time PCR以驗(yàn)證ER、AR以及一些變化較大的影響乳腺發(fā)育的基因的表達(dá)情況。4)免疫組化實(shí)驗(yàn)。對(duì)相關(guān)基因在乳腺中的表達(dá)分布情況進(jìn)行檢測(cè)。5)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。小鼠MEF細(xì)胞中檢測(cè)FKBP52、FOXA1、ERα的表達(dá)情況,人的乳腺癌細(xì)胞系中通過干擾和過表達(dá)FKBP52基因的表達(dá)檢測(cè)FOXA1的變化。6)放線菌酮(CHX)檢測(cè)蛋白穩(wěn)定性。7)Co-IP實(shí)驗(yàn)。探究FKBP52與FOXA1在蛋白水平的相互作用。[結(jié)果]1)突變雄鼠表型區(qū)別于野生雄鼠指長比2D:4D≥1,并且行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示突變雄鼠傾向于待在雄鼠用過的墊料內(nèi),這一選擇與野生雌鼠相似；綜上突變雄鼠表現(xiàn)出雌性化特征；2)RNA測(cè)序結(jié)果顯示突變雄鼠基因表達(dá)譜與野生雌鼠基本一致,FOXA1、CITED1、wnt5a、Col4a2、 sox-15、sox-7、krt6-b、 Ihh、btc、Igfbp2基因發(fā)生明顯變化；3)Real-time驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相同；4)免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在FKBP52敲除雄鼠乳腺中ERa表達(dá)上升,同時(shí)ERa的表達(dá)趨勢(shì)與FOXA1非常相近；5)FKBP52敲除的小鼠MEF細(xì)胞FOXA1表達(dá)缺失,ERa表達(dá)上調(diào),而在野生的MEF細(xì)胞中過表達(dá)FKBP52發(fā)現(xiàn)FOXA1表達(dá)降低的現(xiàn)象,說明FKBP52與FOXA1之間存在極強(qiáng)的調(diào)控關(guān)系,而雌激素處理實(shí)驗(yàn)也證明了FKBP52對(duì)FOXA1的調(diào)控依賴于ER。而在ER(+)的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 和 ER (-)的 SK-BR-3中通過干擾和過表達(dá)FKBP52基因,發(fā)現(xiàn)在ER(+)的MCF-7細(xì)胞內(nèi)降低FKBP52的表達(dá)會(huì)造成FOXA1升高,過表達(dá)FKBP52后FOXA1表達(dá)降低,而在ER(-)的SK-BR-3細(xì)胞則沒有觀察到這種變化,同樣說明FKBP52和FOXA1在細(xì)胞內(nèi)存在直接調(diào)控關(guān)系,并且這種調(diào)控依賴雌激素受體ER；6)放線菌酮處理(CHX)實(shí)驗(yàn)揭示FKBP52降低后FOXA1蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)；7)Co-IP實(shí)驗(yàn)顯示FKBP52和FOXA1在蛋白水平存在直接的相互作用。[結(jié)論]在FKBP52基因敲除雄鼠中,FKBP52的缺失造成了FOXA1蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng),進(jìn)而影響了FOXA1的表達(dá)導(dǎo)致下游ER活性的增強(qiáng)并最終改變ER/AR間的平衡,這可能是產(chǎn)生雄鼠乳腺異常發(fā)育現(xiàn)象的原因。第二部分 一種gRNA快速合成及檢測(cè)方法的建立[目的]建立一種gRNA快速合成及體外檢測(cè)的方法。[方法]設(shè)計(jì)引物并利用PCR技術(shù)迅速擴(kuò)增gRNA的DNA模板片段,然后通過體外轉(zhuǎn)錄純化得到gRNA；最后通過體外反應(yīng)迅速對(duì)gRNA和Cas9酶切效率及特異性進(jìn)行檢測(cè)。[結(jié)果]體外合成的gRNA特異性強(qiáng),活性高,在靶點(diǎn)上成功切開DNA雙鏈。[結(jié)論]成功建立gRNA快速合成及檢測(cè)的方法,為后續(xù)轉(zhuǎn)染或顯微注射篩選有活性gRNA節(jié)約了時(shí)間。
【關(guān)鍵詞】：FKBP52敲除 FOXA1 ER AR 乳腺發(fā)育 CRISPR/Cas9 PCR擴(kuò)增 體外轉(zhuǎn)錄 體外檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R33
【目錄】：

• 第一部分：FKBP52通過FOXA1調(diào)節(jié)雌激素受體ER和雄激素受體AR的平衡4-49
• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 前言8-20
• 材料和方法20-33
• 材料20-23
• 實(shí)驗(yàn)方法23-33
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-46
• 討論46-49
• 第二部分：一種gRNA快速合成及檢測(cè)方法的建立49-59
• 摘要49
• Abstract49-50
• 前言50-51
• 實(shí)驗(yàn)材料51-52
• 實(shí)驗(yàn)方法52-53
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-58
• 討論58-59
• 英文縮略表59-60
• 參考文獻(xiàn)60-68
• 致謝68-69
• 個(gè)人基本情況69-70
• 碩士期間論文發(fā)表情況及學(xué)術(shù)表現(xiàn)70-71

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2 劉丁源;利用多重gRNA介導(dǎo)的CRISPR/Cas技術(shù)對(duì)擬南芥IAA2和小立碗蘚LrgB基因編輯的研究[D];浙江大學(xué);2016年

3 王坤;CRISPR/CAS系統(tǒng)誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組突變及相關(guān)檢測(cè)方法比較[D];河南大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：568930