本文關鍵詞：轉錄因子CREB對TNFAIP1基因調控作用的研究

  更多相關文章： TNFAIP1基因 CREB Forskolin 神經(jīng)元

【摘要】：TNFAIP1是一個被鑒定為受腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導的蛋白,參與了DNA復制和損傷修復、細胞凋亡、調節(jié)細胞骨架結構及某些神經(jīng)退行性疾病病變過程,如:阿爾茲海默癥(AD)。CREB(cAMP response element-binding protein)是一個重要的核轉錄因子,介導了神經(jīng)系統(tǒng)內多條信號轉導通路,在神經(jīng)元的生長、發(fā)育、凋亡,以及突觸可塑性和學習記憶方面有重要調控作用。在本研究中,我們檢測了化學藥物Forskolin、Genistein、Valproic acid和Polydatin對人神經(jīng)母細胞瘤細胞系(SKNSH)內TNFAIP1基因表達的影響,發(fā)現(xiàn)Forskolin可以顯著降低TNFAIP1基因的mRNA水平和啟動子活性。而Forskolin是一種腺苷酸環(huán)化酶激活劑(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP),能激活cAMP-CREB信號通路,因此我們進一步探究了轉錄因子CREB與TNFAIP1基因的調控關系。KG-501是CREB蛋白的特異性抑制劑,實驗證明,它能顯著增強SKNSH細胞內TNFAIP1蛋白水平。因此,當過表達外源野生型CREB時,SKNSH細胞內TNFAIP1基因啟動子活性和蛋白水平顯著降低,說明轉錄因子CREB能負調控TNFAIP1基因的表達。但是過表達突變型的CREBs133a或KCREB卻不能產(chǎn)生類似顯著效果,說明CREB的ser133磷酸化和DNA結合域在轉錄因子CREB調控TNFAIP1基因表達的過程中有重要作用。我們進一步通過生物信息學軟件預測是否TNFAIP1基因近端啟動子區(qū)域內存在CREB結合位點,結果發(fā)現(xiàn)在-50和-196處有兩個cAMP應答元件(CRE)。將這兩個CREs元件進行缺失突變后,CREB對TNFAIP1基因啟動子活性的抑制作用明顯減弱。并且染色體免疫共沉淀實驗(ChIP)也證實,CREB能結合在TNFAIP1基因近端啟動子區(qū)域-290至-5以內,且包含CREs位點。說明CREB是通過結合在TNFAIP1基因近端啟動子區(qū)域內的CRE元件上負調控TNFAIP1基因的表達,并且進一步實驗表明,CREB蛋白ser133的磷酸化在Forskolin下調TNFAIP1基因表達的過程中是不可缺少的。
【關鍵詞】：TNFAIP1基因 CREB Forskolin 神經(jīng)元
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R3416;Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 1. 前言11-23
• 1.1 TNFAIP111-15
• 1.1.1 TNFAIP1基因11
• 1.1.2 TNFAIP1家族11-12
• 1.1.3 TNFAIP1蛋白分布與表達12
• 1.1.4 TNFAIP1功能12-15
• 1.2 CREB蛋白15-20
• 1.2.1 CREB蛋白簡介15
• 1.2.2 CREB蛋白家族簡介15-16
• 1.2.3 CREB相關信號通路16-17
• 1.2.4 CREB轉錄調控機制17-18
• 1.2.5 CREB蛋白功能18-20
• 1.3 阿爾茨海默癥簡介20-21
• 1.4 課題研究背景和意義21-23
• 2. 材料和方法23-41
• 2.1 儀器設備23-24
• 2.2 材料與試劑24-28
• 2.2.1 細胞株和菌株24
• 2.2.2 質粒載體和工具酶24
• 2.2.3 試劑盒和抗體24
• 2.2.4 抗體及藥物24-25
• 2.2.5 其他試劑25
• 2.2.6 溶液配方25-28
• 2.3 實驗方法28-41
• 2.3.1 報告基因載體構建28-29
• 2.3.2 質粒DNA中量制備29-31
• 2.3.3 細胞培養(yǎng)、轉染及藥物處理31-33
• 2.3.4 RNA提取與實時熒光定量PCR33-35
• 2.3.5 熒光素酶實驗35
• 2.3.6 Western blot檢測35-37
• 2.3.7 染色體免疫共沉淀（CHIP）檢測37-40
• 2.3.8 數(shù)據(jù)分析40-41
• 3. 實驗結果41-49
• 3.1 成功構建TNFAIP1及CREs元件缺失突變的螢光素酶報告載體41
• 3.2 Forskolin對SKNSH細胞內TNFAIP1基因mRNA水平和啟動子活性的影響41-43
• 3.3 CREB對SKNSH細胞內TNFAIP1基因表達的影響43-45
• 3.4 CREB依賴CREs元件抑制TNFAIP1基因的啟動子活性45-47
• 3.5 CREB能與TNFAIP1基因的近端啟動子結合47-48
• 3.6 CREB磷酸化對Forskolin引發(fā)的TNFAIP1基因下調作用的影響48-49
• 4. 討論49-51
• 參考文獻51-59
• 中英文縮寫表59-61
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文目錄61-62
• 致謝62

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