本文關(guān)鍵詞：卵轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)樹突狀細(xì)胞成熟及免疫調(diào)節(jié)功能的影響

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【摘要】：卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(OVT)是禽蛋蛋清蛋白中主要的成分,具有多種生物活性。OVT通過抗原遞呈細(xì)胞進(jìn)行外來物質(zhì)(抗原)的吞噬處理和遞呈作用,傳遞信息給免疫細(xì)胞,激活機(jī)體的先天性免疫系統(tǒng),調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞因子的產(chǎn)生,影響淋巴細(xì)胞增殖、T細(xì)胞的成熟與分化,在生物體內(nèi)發(fā)揮著增強(qiáng)免疫功能、抵抗細(xì)菌和病毒感染的作用。樹突狀細(xì)胞(DCs)作為體內(nèi)最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞,能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)外抗原特異性呈遞給幼稚型T細(xì)胞,引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)。目前尚未見OVT對(duì)DCs發(fā)育、成熟、遷移及免疫調(diào)節(jié)分子等的影響報(bào)道。本文通過體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測不同濃度OVT刺激下DCs表面特征性分子表達(dá)量,ELISA測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子水平變化,MLRs測定成熟DCs引發(fā)同種異體小鼠脾臟T細(xì)胞增殖效果,Western-blot測定MAPK通路下p38MAPK、JNK和ERK以及它們的磷酸化蛋白含量,探討OVT對(duì)DCs成熟和免疫調(diào)節(jié)的影響,為后續(xù)的試驗(yàn)提供理論依據(jù)。研究結(jié)果如下:(1)不同濃度(10、25、50、100、200μg/mL)OVT單獨(dú)刺激DCs 48 h后,均能顯著提高DCs表面CD80、CD40和MHC-II分子表達(dá)量,促進(jìn)DCs的成熟;不同濃度OVT與LPS共同刺激DCs 48 h后,10~25μg/mL(低濃度)OVT刺激的DCs表面CD80、CD40和MHC-II分子表達(dá)量顯著高于陽性對(duì)照組(LPS單獨(dú)刺激組),表現(xiàn)為協(xié)同LPS刺激效果,25~200μg/m L(高濃度)OVT刺激的DCs表面CD80、CD40和MHC-II分子表達(dá)量顯著低于陽性對(duì)照組,表現(xiàn)為拮抗LPS刺激效果。因而,OVT單獨(dú)刺激或與LPS共刺激DCs均表現(xiàn)出促進(jìn)DCs成熟的效果,但共刺激下高濃度會(huì)減弱DCs的成熟度。(2)不同濃度OVT單獨(dú)刺激成熟的DCs均能夠引發(fā)同種異體小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖,不同濃度OVT在DCs:T細(xì)胞=1:25時(shí),T細(xì)胞增殖率最高;LPS與不同濃度OVT共同刺激成熟的DCs在低濃度OVT時(shí)能顯著引發(fā)T細(xì)胞增殖,但高濃度OVT對(duì)T細(xì)胞的增殖無顯著影響。以上結(jié)果表明,OVT單獨(dú)刺激或低濃度與LPS共刺激成熟的DCs顯著引發(fā)T淋巴細(xì)胞增殖,但高濃度共刺激DCs無引發(fā)T細(xì)胞增殖的能力。(3)不同濃度OVT單獨(dú)刺激DCs 48 h后,DCs培養(yǎng)上清液中TNF-α含量隨濃度增加而升高,但在200μg/mL時(shí),顯著下降;IL-10的表達(dá)量在200μg/m L時(shí)達(dá)到最大;IL-12p70的表達(dá)量不依賴OVT的劑量,在細(xì)胞上清液中大量存在,且與對(duì)照組無顯著差異,表明OVT單獨(dú)刺激下促炎反應(yīng)占主導(dǎo),在濃度最高時(shí)抗炎反應(yīng)起主導(dǎo)作用,抑制炎癥的繼續(xù)發(fā)展,但I(xiàn)L-12p70的表達(dá)量呈現(xiàn)不依賴OVT濃度。(4)LPS與不同濃度OVT共刺激DCs 48 h,細(xì)胞上清中TNF-α含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì),25μg/m L OVT為轉(zhuǎn)折點(diǎn)。IL-10含量隨OVT濃度增加上調(diào),在OVT濃度為200μg/m L時(shí)達(dá)到最大,共刺激DCs產(chǎn)生的IL-12p70顯著高于單獨(dú)刺激各組,但共刺激組別間無顯著差異。表明OVT與LPS共刺激下低濃度時(shí)主要發(fā)生促炎反應(yīng),高濃度時(shí)抗炎反應(yīng)占主導(dǎo)地位且依賴OVT濃度,IL-12p70總體呈現(xiàn)不依賴共刺激物,但顯著高于OVT單獨(dú)刺激組的釋放量。(5)25μg/m L OVT單獨(dú)刺激DCs一定時(shí)間(4 h、8h、12 h)后,檢測MAPK信號(hào)路徑下的p38MAPK、ERK、JNK及它們的磷酸化蛋白表達(dá)量,結(jié)果表明:OVT單獨(dú)刺激DCs時(shí),ERK、p-ERK表達(dá)量下調(diào),p-p38MAPK、JNK,p-JNK表達(dá)量上調(diào),揭示OVT單獨(dú)刺激DCs的成熟依賴p-p38MAPK、ERK和JNK路徑;LPS與25μg/mL OVT刺激DCs后,DCs內(nèi)p38MAPK、p-p38MAPK、JNK和p-JNK表達(dá)量上調(diào),ERK蛋白和p-ERK蛋白表達(dá)量下調(diào),表明LPS與OVT共刺激DCs的成熟依賴p38MAPK、JNK和ERK三條路徑。
【關(guān)鍵詞】：卵轉(zhuǎn)鐵蛋白 樹突狀細(xì)胞 表型 細(xì)胞因子 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 蛋白免疫印跡
【學(xué)位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 縮略詞10-11
• 第1章 文獻(xiàn)綜述11-22
• 1.1 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白國內(nèi)外研究概況11-14
• 1.1.1 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)11-12
• 1.1.2 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的生理活性12-14
• 1.1.2.1 轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子12-13
• 1.1.2.2 抗菌抗病毒活性13
• 1.1.2.3 抗氧化作用13
• 1.1.2.4 免疫調(diào)節(jié)功能13-14
• 1.1.2.5 抗腫瘤作用14
• 1.2 樹突狀細(xì)胞的生物學(xué)特性14-17
• 1.2.1 DCs的來源和分布14-15
• 1.2.2 DCs的表型15
• 1.2.3 DCs對(duì)抗原的加工和遞呈能力15-16
• 1.2.3.1 外源性抗原的加工和呈遞——溶酶體途徑15-16
• 1.2.3.2 內(nèi)源性抗原的加工和遞呈——蛋白酶體途徑16
• 1.2.3.3 交叉遞呈16
• 1.2.4 DCs的分泌物16-17
• 1.2.5 DCs的遷移17
• 1.2.6 DCs的免疫調(diào)節(jié)功能17
• 1.2.7 DCs與免疫治療17
• 1.3 DCS的體外培養(yǎng)17-18
• 1.3.1 骨髓源DCs培養(yǎng)方法的建立18
• 1.3.2 樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)中純化方法的優(yōu)化18
• 1.4 樹突狀細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑18-20
• 1.5 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)樹突狀細(xì)胞成熟及免疫調(diào)節(jié)功能的研究進(jìn)展20-21
• 1.6 課題來源及研究目的與意義21-22
• 1.6.1 課題來源21
• 1.6.2 研究目的與意義21-22
• 第2章 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)樹突狀細(xì)胞成熟的影響22-29
• 2.1 試驗(yàn)材料與儀器22-23
• 2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物22
• 2.1.2 試劑22
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備22-23
• 2.2 試驗(yàn)方法23-24
• 2.2.1 試劑配制23
• 2.2.2 DCs的分離純化23
• 2.2.3 OVT對(duì)DCs細(xì)胞毒性試驗(yàn)23-24
• 2.2.4 OVT對(duì)細(xì)胞表型的影響24
• 2.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析24
• 2.3 結(jié)果與討論24-28
• 2.3.1 OVT對(duì)DCs的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)24-25
• 2.3.2 OVT對(duì)DCs形態(tài)的影響25-26
• 2.3.3 OVT對(duì)DCs表型的影響26-28
• 2.4 小結(jié)28-29
• 第3章 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)DCS刺激T細(xì)胞增殖的研究29-35
• 3.1 試驗(yàn)材料與儀器29-30
• 3.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物29
• 3.1.2 試驗(yàn)試劑和耗材29-30
• 3.1.3 試驗(yàn)設(shè)備30
• 3.2 試驗(yàn)方法30-31
• 3.2.1 OVT刺激DCs成熟30
• 3.2.2 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的分離30
• 3.2.3 成熟DCs引發(fā)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLRs)30-31
• 3.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析31
• 3.3 試驗(yàn)結(jié)果及討論31-34
• 3.3.1 不同濃度OVT刺激成熟的DCs引發(fā)同種異體T細(xì)胞增殖的能力31-32
• 3.3.2 LPS與不同濃度OVT刺激成熟的DCs引發(fā)同種異體T細(xì)胞增殖的能力32-34
• 3.4 小結(jié)34-35
• 第4章 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)DCS細(xì)胞因子及信號(hào)分子的影響35-51
• 4.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備35-36
• 4.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物35
• 4.1.2 試驗(yàn)試劑及耗材35-36
• 4.1.3 試驗(yàn)設(shè)備36
• 4.2 試驗(yàn)方法36-40
• 4.2.1 試驗(yàn)試劑配制36-37
• 4.2.2 DCs細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子的測定37-38
• 4.2.3 成熟DCs蛋白的提取38
• 4.2.4 蛋白含量的測定38
• 4.2.5 蛋白變性38
• 4.2.6 SDS-PAGE的制備38
• 4.2.7 電泳38-39
• 4.2.8 濕法轉(zhuǎn)膜及檢測39
• 4.2.9 封閉39
• 4.2.10孵育抗體和DAB顯色39-40
• 4.2.11凝膠成像分析及數(shù)據(jù)分析40
• 4.3 結(jié)果與討論40-50
• 4.3.1 TNF-α 細(xì)胞因子的表達(dá)量40-41
• 4.3.1.1 TNF-α 標(biāo)曲的繪制40
• 4.3.1.2 OVT單獨(dú)刺激成熟的DCs產(chǎn)生TNF-α 的量40-41
• 4.3.1.3 LPS與不同濃度OVT共刺激DCs產(chǎn)生TNF-α 的量41
• 4.3.2 IL-10含量測定41-43
• 4.3.2.1 IL-10標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制41-42
• 4.3.2.2 OVT單獨(dú)刺激DCs產(chǎn)生IL-10的量42
• 4.3.2.3 LPS與不同濃度OVT共刺激DCs產(chǎn)生IL-10的量42-43
• 4.3.3 IL-12p70含量的測定43-45
• 4.3.3.1 IL-12p70標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制43-44
• 4.3.3.2 不同濃度OVT單獨(dú)刺激DCs產(chǎn)生IL-12p70的量44
• 4.3.3.3 LPS與不同濃度OVT共刺激DCs產(chǎn)生IL-12p70的量44-45
• 4.3.4 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)路徑中三種蛋白質(zhì)及其磷酸化蛋白含量測定45-50
• 4.3.4.1 總蛋白提取純度及完整性檢測45-46
• 4.3.4.2 p38MAPK和p-p38MAPK蛋白凝膠成像圖和定量分析46-47
• 4.3.4.3 JNK和p-JNK蛋白含量的凝膠成像圖和定量分析47-48
• 4.3.4.4 ERK和p-ERK蛋白含量的凝膠成像圖和定量分析48-50
• 4.4 小結(jié)50-51
• 結(jié)論與展望51-52
• 1 結(jié)論51
• 2 展望51-52
• 參考文獻(xiàn)52-60
• 致謝60-61
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果61
• 1、論文發(fā)表情況61
• 2、參與科研項(xiàng)目情況61

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本文編號(hào)：535244