本文關(guān)鍵詞：錦南復(fù)方改善2型糖尿病模型大鼠胰島素抵抗及機制初探

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【摘要】：目的2型糖尿病是由于胰島素分泌相對不足或胰島素作用障礙所致的以血糖升高為主要特征的一種代謝性疾病,其中胰島素抵抗(Insulin resistance, IR)是2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM)的典型特征,也是T2DM的發(fā)病基礎(chǔ)。2型糖尿病是危害人類健康的嚴(yán)重的代謝性疾病,且發(fā)病率逐年攀升,2型糖尿病及其并發(fā)癥所導(dǎo)致的死亡率呈上升趨勢�，F(xiàn)有治療2型糖尿病的主要措施包括飲食控制、運動,在控制效果不佳的情況下選擇口服降糖藥物,必要時可用胰島素。大部分2型糖尿病患者服用口服降糖藥,如雙胍類、磺酰脲類、噻唑烷二酮類藥物。但是長期服用可導(dǎo)致如白細胞減少、溶血性貧血、損傷消化道等不良反應(yīng)。近年來,中藥以其服用方便、安全低毒、調(diào)節(jié)血糖作用溫和等特點凸顯優(yōu)勢。錦南復(fù)方(Jin Nan Compound, JNC)為蘇州太倉當(dāng)?shù)氐拿耖g驗方,對防治糖尿病、高血壓等具有重要意義。本論文旨在通過體內(nèi)、外實驗驗證錦南復(fù)方降低血糖、改善2型糖尿病胰島素抵抗的作用,并進一步研究JNC對胰島素受體物-1絲氨酸磷酸化(phosphorylation-Insulin Receptor Substrate 1 Serine 307, p-IRS-1 Ser307)、磷酸酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-Kinase, PI3K)、葡萄糖轉(zhuǎn)運體4 (Glucose Transporter 4, GLUT-4)蛋白表達的影響,初步探明JNC改善IR的作用機制。方法第一部分：HepG2細胞置于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。取傳代培養(yǎng)的HepG2細胞,將細胞以103個/孔接種于96孔板,37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基,PBS清洗1次,加入含有10μg/ml胰島素的培養(yǎng)基200μL, HepG2細胞于37℃,5%CO2條件培養(yǎng)24 h,建立IR細胞模型。取IR模型細胞分別設(shè)為對照組、模型組、JNC高、中、低劑量組。JNC組分別加入120,60,30μg/ml JNC。每組設(shè)6個復(fù)孔,加入受試藥物24 h后通過葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法(GOD-POD)測定培養(yǎng)液的葡萄糖濃度,計算葡萄糖吸收率。采用MTT法檢測JNC對HepG2細胞增殖的抑制率。運用Western-Blot法檢測p-IRS-1 Ser307、PI3K、GLUT-4表達,分析JNC干預(yù)對IR模型細胞相關(guān)蛋白的影響。第二部分：雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。按50mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)建立化學(xué)性損傷糖尿病大鼠模型,選擇空腹血糖值高于11.1mmol/1的成模大鼠隨機分為模型組、陽性對照組(參芪顆粒300mg/kg)、錦南復(fù)方高、中、低(300,150,75mg/kg)3個劑量組,每組10只。分別灌胃給予受試藥與陽性對照藥,對照組、模型組灌胃等容量生理鹽水。實驗第3周,大鼠禁食12 h,進行口服糖耐量實驗(OGTT)。末次給藥后禁食12 h,不禁水,眼內(nèi)眥取血,分離血清4℃冰箱保存待測；分離并稱量：心、肝、脾、肺、腎臟組織,計算臟器系數(shù)。第三部分：雄性SD大鼠,正常組(10只)給予基礎(chǔ)飼料,其余50只大鼠喂養(yǎng)高脂飼料4周后,按45 mg/kg體重腹腔注射STZ建立2型糖尿病大鼠IR模型。將成模大鼠隨機分為模型組.JNC 160 mg/kg組、NC 80 mg/kg組、JNC 40 mg/kg組,陽性對照二甲雙胍200mg/kg組。各組繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng),并灌胃給予相應(yīng)的受試藥物,對照組給予基礎(chǔ)飼料。對照組與模型組灌胃給予等容積生理鹽水,每天上午給藥1次,連續(xù)干預(yù)4周,每周稱重1次,隨體重增減及時調(diào)整給藥量。至實驗第3周,禁食12小時,進行口服糖耐量實驗。末次給藥后禁食12小時,眼內(nèi)眥取血,分離血清,檢測血糖、血脂、胰島素水平；取部分肝臟制備肝勻漿,離心分離上清,測定肝糖原水平；分離肝、胰腺組織制作切片,進行組織形態(tài)學(xué)檢查,觀察有無病理改變。使用免疫組化法測肝臟中GLUT-4、p-IRS-1 Ser307表達水平。結(jié)果第一部分：HepG2細胞置于含10μtg/ml胰島素培養(yǎng)液孵育24 h,與對照組比較,葡萄糖吸收率下降,表明建模成功。模型細胞經(jīng)不同濃度的JNC干預(yù),與模型組比較,葡萄糖吸收率顯著增加。模型細胞GLUT-4、PI3K蛋白表達顯著高于IR細胞,而p-IRS-1 Ser307水平則明顯受到抑制。給予不同劑量JNC干預(yù)后,GLUT、PI3K蛋白表達顯著上調(diào),IRS-1Ser307磷酸化顯著受抑。第二部分：與模型組比較,：NC 150,75 mg/kg劑量組可顯著降低鏈佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病模型大鼠空腹血糖、餐后血糖升高,增強糖尿病模型大鼠的葡萄糖耐受能力。實驗期間,未見糖尿病大鼠行為活動異�，F(xiàn)象。第三部分：JNC40、80、160 mg/kg劑量下可顯著降低糖尿病大鼠空腹血糖(Fasting Blood Glucose, FBG),餐后血糖(Postprandial Blood Glucose, PBG)、糖化血紅蛋白(Glycosylated Hemoglobulin A1C, HbAlc);亦可下調(diào)總膽固醇(Total Cholesterol, TC).甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein-Cholesterol, LDL-C)、游離脂肪酸(Free Fatty Acid, FFA)、空腹血清胰島素(Fasting Insulin, FINS)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)及胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis model assessment index for insulin resistance,HOMA-IR);上調(diào)肝糖原(Hepatic glycogen), GLUT-4表達,抑制IRS-1Ser307磷酸化水平,可有效改善糖尿病大鼠葡萄糖代謝及脂肪代謝。JNC各劑量組可有效改善模型大鼠受損的胰島β細胞的形態(tài),改善胰島β細胞分泌胰島素的功能。此外,JNC3個劑量通過減少自由基以及游離脂肪酸生成,可減輕肝細胞損傷,顯著緩解肝腫大。結(jié)論1、JNC對胰島素抵抗大鼠及IR細胞具有改善作用,能有效增強機體與細胞對葡萄糖的消耗能力,推測該作用與JNC上調(diào)肝臟GLUT-4蛋白表達,增強細胞P13K蛋白表達,抑制IRS-1絲氨酸磷酸化相關(guān)。2、JNC有效減少脂肪脂解,改善機體脂質(zhì)代謝以及FFA代謝,從而降低機體循環(huán)FFA水平,改善了IR狀態(tài),此作用可能與抗氧化活性有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：2型糖尿病 胰島素抵抗 葡萄糖轉(zhuǎn)運體-4 胰島素受體底物-1 磷酸酰肌醇-3-激酶 錦南復(fù)方
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R285.5;R-332
【目錄】：

• 摘要2-5
• Abstract5-11
• 符號說明11-12
• 前言12-14
• 第一章 錦南復(fù)方改善HepG2細胞胰島素抵抗14-22
• 1. 材料14-16
• 1.1 藥品與試劑14-15
• 1.2 儀器15-16
• 2 方法16-18
• 2.1 HepG2細胞培養(yǎng)16
• 2.2 錦南復(fù)方對HepG2細胞增殖的影響16
• 2.3 建立HepG2 IR細胞模型16
• 2.4 鑒定HepG2 IR細胞模型16
• 2.5 總蛋白提取16
• 2.6 錦南復(fù)方對HepG2 IR模型細胞葡萄糖消耗的影響16-17
• 2.7 錦南復(fù)方對IR HepG2細胞GLUT-4,p-IRS-1 Ser307及PI3K蛋白表達的影響17-18
• 2.8 統(tǒng)計學(xué)方法18
• 3. 結(jié)果18-20
• 3.1 錦南復(fù)方對HepG2細胞增殖的影響18
• 3.2 胰島素誘導(dǎo)HepG2細胞建立IR模型18-19
• 3.3 錦南復(fù)方對HepG2 IR細胞葡萄糖的影響19
• 3.4 錦南復(fù)方對胰島素抵抗細胞IRS-1 Ser307磷酸化的影響19
• 3.5 錦南復(fù)方對胰島素抵抗細胞PI3K表達的影響19-20
• 3.6 錦南復(fù)方對胰島素抵抗細胞GLUTM表達的影響20
• 4. 小結(jié)20-22
• 第二章 錦南復(fù)方對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型大鼠血糖的影響22-28
• 1. 材料22-23
• 1.1 藥物與試劑22
• 1.2 儀器22-23
• 1.3 動物23
• 2. 方法23-24
• 2.1 建立鏈佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型23
• 2.2 分組、干預(yù)及樣本處理23
• 2.3 指標(biāo)檢測及方法23
• 2.4 口服糖耐量實驗23-24
• 2.5 數(shù)據(jù)分析24
• 3 結(jié)果24-27
• 3.1 錦南復(fù)方對糖尿病大鼠空腹血糖的影響24
• 3.2 錦南復(fù)方對糖尿病大鼠餐后血糖的影響24-25
• 3.3 錦南復(fù)方對糖尿病模型大鼠口服糖耐量的影響25-26
• 3.4 錦南復(fù)方對糖尿病模型大鼠臟器系數(shù)的影響26-27
• 4. 小結(jié)27-28
• 第三章 錦南復(fù)方對胰島素抵抗模型大鼠血糖及肝臟相關(guān)蛋白表達的影響28-42
• 1. 材料28-29
• 1.1 藥物與試劑28-29
• 1.2 儀器29
• 1.3 動物29
• 2. 方法29-32
• 2.1 建立2型糖尿病大鼠模型29-30
• 2.2 分組、給藥及樣本處理30
• 2.3 指標(biāo)檢測及方法30
• 2.4 口服糖耐量實驗30
• 2.5 肝糖原含量測定30-31
• 2.6 石蠟切片制作及處理31
• 2.7 H&E染色31
• 2.8 免疫組化法檢測肝臟組織相關(guān)蛋白表達31-32
• 2.9 數(shù)據(jù)分析32
• 3 結(jié)果32-41
• 3.1 錦南復(fù)方對大鼠糖化血紅蛋白、血糖、肝糖原的影響32-33
• 3.2 錦南復(fù)方對大鼠血脂水平的影響33-34
• 3.3 錦南復(fù)方對大鼠空腹血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、游離脂肪酸的影響34-35
• 3.4 錦南復(fù)方對大鼠血清丙二醛、谷胱甘肽水平的影響35-36
• 3.5 錦南復(fù)方對糖尿病模型大鼠體重、攝食量、飲水量的影響36-37
• 3.6 錦南復(fù)方對大鼠口服糖耐量的影響37
• 3.7 錦南復(fù)方對大鼠肝臟GLUT-4蛋白表達的影響37-39
• 3.8 錦南復(fù)方對大鼠肝臟p-IRS-1 Ser307蛋白表達的影響39-40
• 3.9 錦南復(fù)方對大鼠胰島β細胞形態(tài)的影響40
• 3.10 錦南復(fù)方對大鼠肝臟組織病理形態(tài)變化的影響40-41
• 4. 小結(jié)41-42
• 討論42-46
• 參考文獻46-51
• 文獻綜述51-65
• 參考文獻59-65
• 致謝65-66
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄66-67

【參考文獻】

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本文編號：523236