發(fā)布時(shí)間：2017-07-03 15:12

  本文關(guān)鍵詞：TLR2在HMGB1誘導(dǎo)的小鼠系膜細(xì)胞增殖中的作用及其可能機(jī)制

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【摘要】：目的：本實(shí)驗(yàn)以小鼠系膜細(xì)胞為研究對(duì)象，以重組鼠HMGB1為刺激物，試圖通過(guò)檢測(cè)其受體Toll樣受體2(TLR2)的誘導(dǎo)表達(dá)情況及沉默其受體后，細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，初步探討HMGB1通過(guò)其受體對(duì)系膜細(xì)胞的促增殖作用。 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，其特征是多器官受累，產(chǎn)生抗核抗體及免疫復(fù)合物的沉積[1]。狼瘡性腎炎（Lupus nephritis，LN）被視為SLE最嚴(yán)重之一的器官表現(xiàn)，影響約35％至50％的狼瘡患者。盡管對(duì)其發(fā)病機(jī)制有了深入的了解，其臨床治療效果越來(lái)越好，但狼瘡性腎炎仍是SLE患者死亡的主要原因。 高遷移率族蛋白-1（High mobility group protein-1,HMGB1）是一個(gè)被發(fā)現(xiàn)在所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的核內(nèi)蛋白，被稱為DNA結(jié)合蛋白，參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[2]。而細(xì)胞外HMGB1已被確定為一種炎癥介質(zhì)，由于其促炎性和免疫刺激特性，參與多種慢性炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)病[3]。HMGB1不但由活化的免疫細(xì)胞主動(dòng)分泌（如巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞），而且也被動(dòng)地從損傷或壞死細(xì)胞中釋放[4]。此外，HMGB1誘導(dǎo)產(chǎn)生其它細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素-1（IL-1）、IL-6和IL-8，并且它還是一種內(nèi)皮細(xì)胞的激活劑，導(dǎo)致粘附分子的上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，在不同的炎癥性疾病中如敗血癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)-MATIC抗體（ANCA）相關(guān)性血管炎、慢性腎臟疾病以及SLE[5]均伴有血清中HMGB1表達(dá)升高。另外，與活動(dòng)性狼瘡（非腎臟損害）的患者相比，在活動(dòng)性狼瘡性腎病患者血清中HMGB1水平明顯增高[6]。我們前期的實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了HMGB1及其可能受體TLR2、4在狼瘡性腎炎患者外周血及狼瘡小鼠腎組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，HMGB1及TLR2、4在狼瘡性腎炎發(fā)病過(guò)程中明顯高表達(dá)，同時(shí)與系膜細(xì)胞的增生密切相關(guān)，推斷HMGB1可能通過(guò)與其受體結(jié)合參與了狼瘡時(shí)系膜細(xì)胞的異常增殖，促進(jìn)了增生性腎小球腎炎的發(fā)生，但其確切機(jī)制，目前尚不清楚。 方法：選取小鼠系膜細(xì)胞MMC為研究對(duì)象，1）為了確定HMGB1對(duì)小鼠系膜細(xì)胞增殖的影響，將小鼠系膜細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組及50μg/LHMGB1刺激組、100μg/L HMGB1刺激組和200μg/LHMGB1刺激組，分別培養(yǎng)2、4、8和12h，收集不同時(shí)間點(diǎn)不同濃度刺激的細(xì)胞，以BrdU摻入法檢測(cè)小鼠系膜細(xì)胞的增殖水平。2）為了檢測(cè)HMGB1對(duì)小鼠系膜細(xì)胞TLR2、PCNA、Cyclin D1、CDK4、p16表達(dá)的影響，將常規(guī)培養(yǎng)的MMC細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組及100μg/LHMGB1刺激組，分別于培養(yǎng)2、4、6、8和12h時(shí)收集細(xì)胞，采用Real-time PCR及Western Blot檢測(cè)小鼠系膜細(xì)胞TLR2、 PCNA、CyclinD1、CDK4、p16的表達(dá)變化。3）為了明確TLR2表達(dá)與HMGB1介導(dǎo)的MMC增殖中的作用，將MMC細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、HMGB1刺激組（100μg/L）、HMGB1刺激+pYr-3.1-shTLR2組（轉(zhuǎn)染組）、HMGB1刺激+空白質(zhì)粒組（空白質(zhì)粒組），，刺激8h時(shí)收集細(xì)胞，Western Blot檢測(cè)pYr-3.1-shTLR2的沉默效果及細(xì)胞周期蛋白PCNA、CyclinD1、CDK4、p16蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)果： 1HMGB1上調(diào)小鼠系膜細(xì)胞增殖水平 以HMGB1刺激小鼠系膜細(xì)胞，在刺激2h，小鼠系膜細(xì)胞的增殖水平開(kāi)始逐漸上升，至HMGB1作用8h，小鼠系膜細(xì)胞的增殖水平最高，至作用12h后其增殖水平稍有降低，但與8h相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BrdU結(jié)果顯示，100μg/L及200μg/L濃度刺激下的增殖水平明顯高于50μg/L濃度時(shí)，但200μg/L與100μg/L相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2HMGB1時(shí)間依賴性上調(diào)小鼠系膜細(xì)胞TLR2的表達(dá) Real-time PCR結(jié)果顯示，HMGB1明顯上調(diào)TLR2mRNA表達(dá)，至HMGB1作用6h，TLR2的mRNA表達(dá)升高最明顯(2.2±0.16)，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），至作用12h后其表達(dá)水平逐漸回落，但仍高于正常組。 Western Blot結(jié)果顯示：HMGB1時(shí)間依賴性上調(diào)TLR2蛋白表達(dá)，至HMGB1作用8h蛋白表達(dá)達(dá)高峰(0.55±0.02)，12h時(shí)略有下降，但仍高于正常對(duì)照組（0.1±0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 3HMGB1刺激能夠上調(diào)小鼠系膜細(xì)胞中PCNA mRNA及蛋白的表達(dá) HMGB1能夠誘導(dǎo)PCNA mRNA和蛋白表達(dá)升高，呈時(shí)間依賴性。mRAN表達(dá)在刺激6h達(dá)高峰(1.9±0.13)，而PCNA蛋白在8h時(shí)達(dá)高峰（0.56±0.02），12h逐漸回落，與正常對(duì)照組相比（0.28±0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 4HMGB1刺激能夠上調(diào)小鼠系膜細(xì)胞中CyclinD1、CDK4mRNA及蛋白的表達(dá) HMGB1上調(diào)CyclinD1、CDK4mRNA表達(dá)，至HMGB1刺激6h時(shí)表達(dá)水平最高(1.8±0.14、1.6±0.12)，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），而至HMGB1作用12h后其表達(dá)水平逐漸回落。 Western Blot結(jié)果顯示：HMGB1上調(diào)CyclinD1、CDK4蛋白表達(dá)，至HMGB1作用8h蛋白表達(dá)達(dá)峰（0.43±0.02、0.23±0.01），與正常對(duì)照組相比（0.14±0.01、0.04±0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），至作用12h后逐漸回落，但仍高于正常對(duì)照組。 5HMGB1刺激后能夠時(shí)間依賴性地降低小鼠系膜細(xì)胞中p16的表達(dá) 與正常對(duì)照組相比，至HMGB1作用2、4、6、8及12h時(shí)小鼠系膜細(xì)胞中p16mRNA及蛋白的表達(dá)水平呈持續(xù)降低趨勢(shì)，呈時(shí)間依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 6RNA干擾沉默TLR2表達(dá)，能夠有效地下調(diào)HMGB1誘導(dǎo)的小鼠系膜細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，降低系膜細(xì)胞的增殖水平 與HMGB1刺激組相比（0.55±0.02、0.28±0.01、0.27±0.01、0.06±0.01），pYr-3.1-shTLR2轉(zhuǎn)染組的小鼠系膜細(xì)胞的PCNA、CyclinD1、CDK4表達(dá)下降(0.28±0.01、0.10±0.01、0.10±0.01)，p16表達(dá)上調(diào)（0.14±0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論：HMGB1誘導(dǎo)了小鼠系膜細(xì)胞TLR2的表達(dá)，伴有細(xì)胞增殖水平升高和PCNA、Cyclin D1、CDK4表達(dá)上調(diào)，考慮HMGB1可能通過(guò)與小鼠系膜細(xì)胞膜表面受體TLR2結(jié)合后，通過(guò)某種信號(hào)途徑上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinD1、CDK4的表達(dá)，并下調(diào)細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑p16的表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，細(xì)胞增殖水平提高。但這只是細(xì)胞水平的初步研究，關(guān)于TLR2在HMGB1介導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖中的確切作用，尚需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。
【關(guān)鍵詞】：狼瘡性腎炎 高遷移率族蛋白1 Toll樣受體2 CyclinD1 CDK4 p16 PCNA 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 目錄3-4
• 摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13-14
• 材料與方法14-23
• 結(jié)果23-26
• 附圖26-32
• 附表32-35
• 討論35-38
• 結(jié)論38
• 參考文獻(xiàn)38-42
• 綜述 HMGB1—一個(gè)風(fēng)濕性疾病的危險(xiǎn)信號(hào)42-55
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 致謝55-56
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷56

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 張健;帥朝霞;胡志剛;王春新;袁勁松;陳國(guó)千;;JAK/STAT通路在脂多糖誘導(dǎo)肝細(xì)胞HMGB1釋放中的作用[J];南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2009年11期

2 封曉娟;劉淑霞;呂欣;徐寧;;HMGB1對(duì)小鼠系膜細(xì)胞細(xì)胞周期及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2011年11期

3 劉淑霞;郝軍;郭惠芳;陳寧;劉青娟;唐麗娟;吳海江;段惠軍;;HMGB1/TLR/NF-κB在狼瘡性腎炎小鼠腎組織中的表達(dá)及意義[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2009年05期

4 唐麗娟;郝軍;陳寧;郭惠芳;劉青娟;劉淑霞;;TLR/STAT通路在HMGB1誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖中的作用[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2009年07期

5 封曉娟;劉淑霞;張玉軍;郭惠芳;郝軍;陳寧;唐麗娟;劉青娟;吳海江;;NF-κB信號(hào)途徑在小鼠狼瘡性腎炎發(fā)病中的可能作用[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2010年02期

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本文編號(hào)：514136