本文關鍵詞：普通棉耳狨猴腺病毒5型中和抗體水平測定

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【摘要】：腺病毒(Adeno virus)是一種從腺樣體組織分離培養(yǎng)得到的雙鏈DNA病毒,主要在細胞核內(nèi)繁殖。它不僅是呼吸道、結膜和腸道感染的常見病原體,還能引起無菌性腦膜炎、腦炎、心肌炎和肝炎等疾病。腺病毒在自然界廣泛流行,具有傳染性強,宿主范圍廣的特點,尤其對于嬰幼兒、老人、HIV感染者、移植手術患者等免疫功能低下的人群,腺病毒更是常見的感染因素之一。隨著免疫學、病毒學、分子生物學等多學科的相互滲透和發(fā)展,腺病毒在分子水平上的應用越來越廣泛,特別是有關腺病毒感染、抗腺病毒治療和腺病毒載體應用己成為研究的熱點。病毒載體疫苗是指以病毒作為載體,將保護性抗原基因重組到病毒基因組中,使用能表達保護性抗原基因的重組病毒制成的疫苗。這種疫苗多為活疫苗,且用量少,抗原的免疫原性接近天然,抗原也不需要純化,接種后靠重組體在機體內(nèi)大量表達保護性抗原刺激機體產(chǎn)生特異性免疫保護反應,載體本身亦可發(fā)揮佐劑效應來增強免疫效果。多種病毒載體如腺病毒、腺相關病毒、單純皰疹病毒、痘病毒、逆轉錄病毒、微小RNA病毒、桿狀病毒等,都己用于疫苗研究,其中腺病毒載體、腺相關病毒載體、痘病毒載體、甲病毒載體等病毒載體疫苗己進入人體臨床試驗階段。在這些病毒載體中,人腺病毒載體具有以下優(yōu)點：①可裝載外源基因容量大；②安全性好；③規(guī)�；a(chǎn)工藝成熟,制劑穩(wěn)定性好,并可在懸浮培養(yǎng)中獲得較高的滴度；④宿主范圍廣,可感染靜止和分裂的細胞；⑤腺病毒血清型豐富,疫苗載體選擇廣；⑥腺病毒載體能感染呼吸道和腸道細胞,可以方便地通過黏膜進行免疫,并能誘導機體產(chǎn)生黏膜和系統(tǒng)免疫應答；⑦免疫原性強,能產(chǎn)生很強的體液與細胞免疫；⑧轉導效率高,這些優(yōu)點使腺病毒作為載體的基因治療和疫苗研究迅速發(fā)展。目前,應用最多的腺病毒載體是人血清腺病毒5型(Human Mastadenovirus 5, AdHu5),主要原因是它的免疫原性比其他腺病毒亞型更強。以重組復制缺陷型人腺病毒5型(rAd5)為載體的疫苗,能誘導機體產(chǎn)生強烈的針對目的抗原的免疫應答,因此被廣泛應用于人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒、瘧疾、結核等多種病原體的疫苗研制。然而,近20年來科學家們研究的重點在于探究限制AdHu5的臨床使用的原因： (1)往人體內(nèi)靜脈注射AdHu5載體時高強度的天然免疫毒性；(2)與劑量依賴相關的肝毒性；(3)全世界人體內(nèi)存在針對AdHu5的高預存適應性免疫,即人體內(nèi)存在高滴度的預存中和抗體。由rAD5載體介導的HIV疫苗的臨床試驗失敗表明,人體內(nèi)較高滴度的Ad5中和抗體水平會顯著降低載體轉導效率和外源基因表達水平,并且可能引發(fā)機體產(chǎn)生不良反應。但AdHu5載體疫苗可以在與人基因同源性高達99.9%的非人靈長類動物模型上,對疫苗所要引起保護性免疫的目的基因進行免疫原性和耐受性等的評價。因此,首先需要在這種非人靈長類動物上進行AdHu5中和抗體水平檢測。近年來,一種廣泛應用于基礎生物學、藥理學和毒理學研究的新世界靈長類動物——普通棉耳狨猴(common marmoset,學名Callithrix jacchus)已走入科學界。普通棉耳狨猴是一種原產(chǎn)于巴西東北部大西洋沿海森林的新世界非人靈長類動物,屬絨科(Callitrichidae)。與其他靈長類動物相比,普通棉耳狨猴的壽命較短,一般在18～24個月成年,雌性狨猴3歲后可繁殖后代,8歲就步入老年期。由于壓縮的壽命及良好的繁殖效率,科學家認為狨猴可滿足快速擴充實驗動物數(shù)量及限制實驗動物增殖的需求。成年普通棉耳狨猴重約350～400克,體型小巧,性情溫順,對環(huán)境的破壞能力極小,因此適用于人工飼養(yǎng)繁殖及實驗需求,這一優(yōu)勢帶來的巨大效應不僅減少了喂養(yǎng)成本和空間需求,更增加了實驗材料的利用效率。多種實驗證明,普通棉耳狨猴是一個優(yōu)秀的研究老化、生殖、神經(jīng)學、毒理學和傳染病的模型。狨猴模型的大幅度使用對加速疫苗的臨床前開發(fā)過程及高致病性病毒的治療起了巨大的推動作用。但有學者研究巴西與美國新世界猴體內(nèi)腺病毒水平,發(fā)現(xiàn)有來自巴西的普通棉耳狨猴中人腺病毒5型中和抗體陽性率為31.3%,而美國的普通棉耳狨猴暫未發(fā)現(xiàn)陽性,可能與飼養(yǎng)環(huán)境及接觸生物有關。而我國引進飼養(yǎng)和繁殖的普通棉耳狨猴的人腺病毒5型中和抗體水平未見報道。本實驗室課題組前期構建了HCV/GBV-B嵌合病毒感染狨猴模型,預以該狨猴模型進行腺病毒載體丙型肝炎病毒候選疫苗的臨床前評價,首先需以人腺病毒5型作為載體,在狨猴模型上對所要研究的病毒基因進行免疫原性和耐受性等的評價,因此在使用載體前檢測其體內(nèi)人5型腺病毒的中和抗體水平就顯得極為重要。目的：本研究旨在測定普通棉耳狨猴血清中的腺病毒5型中和抗體水平,評價采用化學發(fā)光法或流式細胞術分別測定熒光素酶或綠色熒光蛋白表達抑制情況的中和檢測方法,評估普通棉耳狨猴作為重組腺病毒5型疫苗臨床前研究的動物模型的可行性與適用性,為臨床前試驗用HCV疫苗候選株與產(chǎn)品的研發(fā)、最終實現(xiàn)HCV疫苗研制成功并在我國產(chǎn)業(yè)化提供重要背景信息。方法：目前對人或動物血清中和抗體的檢測方法有兩種,一種是野生型腺病毒被抗體中和后,觀察感染細胞產(chǎn)生的細胞病變效應(CPE)；另一種則是復制缺陷腺病毒與血清中抗體反應后,讀取其介導的轉基因表達抑制情況,較常使用的報告基因包括熒光素酶(Luciferase)、綠色熒光蛋白(Zs Green)、半乳糖苷酶基因(LacZ)等。由于CPE的觀察較主觀,細胞培養(yǎng)時間較長,不適宜快速檢測大樣本血清,因此本實驗選取后一種檢測方法,即構建同時表達Luciferase與ZsGreen報告基因的重組復制缺陷型5型腺病毒,來檢測普通棉耳狨猴血清中的腺病毒5型中和抗體水平。首先通過PCR技術從質(zhì)粒pHAGE-CMV-Luc-IZs Green中擴增Luc-IZs Green目的基因,同時通過引物設計分別在目的基因5'、3'端引入EcoRI與NheI酶切位點。將目的序列插入腺病毒表達質(zhì)粒pDC315中,構建成重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-Luc-IZs Green。接著利用脂質(zhì)體轉染的方法將構建好的腺病毒穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒pBHGlox(delta)E1,3Cre按一定比例轉染能提供反式作用E1蛋白的人胚腎293A包裝細胞,從而包裝成具有一定感染活性的攜帶Luciferase與Zs Green報告基因的重組腺病毒rAd5/LUC/Zs Green。對包裝好的rAd5/LUC/Zs Green進行3次空斑形成實驗,篩選單克隆重組腺病毒,并將低滴度單克隆病毒原液于293A細胞中進行大量擴增。rAd5/LUC/Zs Green大量擴增后采用氯化銫密度梯度離心法對其進行濃縮純化,并通過50%組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)測得純化后重組腺病毒的感染滴度。通過分子克隆技術鑒定純化后重組腺病毒仍攜帶Luciferase與Zs Green報告基因,即分別采用PCR或RT-PCR擴增純化后rAd5/LUC/Zs Green的基因組DNA或細胞內(nèi)總RNA中的Luc-IZs Green基因片段。同時使用細胞免疫組化實驗驗證重組腺病毒蛋白在293A細胞中是否有表達。再將純化后rAd5/LUC/Zs Green進行倍比稀釋感染293A細胞,檢測熒光素酶與綠色熒光蛋白報告基因的表達效率,確定腺病毒中和實驗的最佳病毒感染滴度。最后將25只普通棉耳狨猴的血清進行倍比梯度稀釋,與最佳感染滴度的重組腺病毒混合后感染293A細胞,24小時后分別采用化學發(fā)光法與流式細胞術相應檢測Luciferase與Zs Green報告基因。通過兩種報告基因的讀數(shù)判定狨猴有無中和抗體及其抗體滴度。結果：(1)重組穿梭質(zhì)粒構建用分子克隆常規(guī)的方法成功構建與正確鑒定含有兩種報告基因的腺病毒穿梭載體pDC315-Luc-IZs Green,并通過瞬時轉染293A細胞的方法初步鑒定能正確表達標簽蛋白。(2)重組腺病毒包裝與滴度測定通過共轉染構建好的腺病毒穿梭質(zhì)粒和ADMax包裝系統(tǒng)的骨架質(zhì)粒至293A細胞,成功包裝rAd5/LUC/Zs Green。經(jīng)過3次空斑形成實驗、大量擴增單克隆重組腺病毒并對其進行濃縮純化后,采用TCID50方法測得腺病毒滴度為6.9×1011.5PFU/ml。(3)重組腺病毒鑒定通過PCR與RT-PCR擴增出基因組DNA與轉錄總RNA的Luc-IZs Green基因片段,鑒定純化后的重組腺病毒攜帶目的基因,并通過細胞免疫組化驗證病毒衣殼蛋白可以在293A細胞中表達。將rAd5/LUC/Zs Green進行倍比稀釋感染293A細胞,檢測熒光素酶與綠色熒光蛋白報告基因的表達效率,顯示6.9×106.5PFU/ml～6.9× 107.5PFU/ml是適宜的中和實驗腺病毒感染滴度。(4)普通棉耳狨猴中和抗體水平檢測流式細胞術檢測綠色熒光細胞百分率結果顯示,共有5只(20%)普通棉耳狨猴血清人腺病毒5型中和抗體陽性,其中有4只的中和抗體滴度為1/16,另1只滴度為1/64。而通過化學發(fā)光法檢測相對熒光素酶活性單位的結果顯示,25只普通棉耳狨猴中共有7只(28%)可檢測到中和抗體,其中有4只的中和抗體滴度為1/16,2只滴度為1/32,1只滴度為1/128。(5)兩種檢測方法對比統(tǒng)計分析顯示,化學發(fā)光法與流式細胞術檢測結果在統(tǒng)計學上具有一致性(P0.01),但略有差異。通過詳細比較可知以Luciferase報告基因為主的化學發(fā)光法是更簡便、靈敏、準確、穩(wěn)定的實驗方法。結論：(1)采用新型ADMax腺病毒包裝系統(tǒng),包裝出同時攜帶熒光素酶與綠色熒光蛋白報告基因的重組腺病毒rAd5/LUC/Zs Green.(2)檢測了我國25只普通棉耳狨猴中預存腺病毒5型抗體水平。普通棉耳狨猴的抗Ad5血清流行率約為20%-30%,但抗體水平均低,多數(shù)滴度是1/16,少數(shù)在1/32,極少出現(xiàn)中高滴度。(3)比較以Luciferase或Zs Green報告基因表達的抑制情況計算得出中和抗體水平的兩種不同檢測方法,證實化學發(fā)光法是重復性高、靈敏度高、穩(wěn)定性強,適宜多物種大樣本實驗設計的檢測方法。(4)研究結果為普通棉耳狨猴成為評價人腺病毒5型或其他稀有腺病毒亞型載體候選疫苗的動物模型提供基礎數(shù)據(jù)。
【關鍵詞】：普通棉耳狨猴 腺病毒5型 中和抗體 熒光素酶 綠色熒光蛋白
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R373
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 1 前言17-34
• 1.1 腺病毒生物學特征18-21
• 1.2 腺病毒感染性21-23
• 1.3 腺病毒載體疫苗的研究進展23-25
• 1.4 重組人腺病毒5型疫苗載體應用25-29
• 1.5 普通棉耳狨猴特征、用途及腺病毒流行情況29-33
• 1.6 立題意義33-34
• 2 材料34-40
• 2.1 材料34-36
• 2.2 菌株、質(zhì)粒和細胞株36
• 2.3 主要儀器與耗材36-38
• 2.4 主要溶液配置38-40
• 3 方法40-57
• 3.1 攜帶LUC-ZS Green報告基因重組穿梭載體的構建40-45
• 3.2 重組穿梭質(zhì)粒的瞬時轉染與鑒定45-47
• 3.3 重組腺病毒的構建、篩選、擴增、純化與滴度測定47-51
• 3.4 重組腺病毒的鑒定51-55
• 3.5 檢測普通棉耳狨猴血清腺病毒5型中和抗體方法55-56
• 3.6 統(tǒng)計學分析56-57
• 4 結果57-70
• 4.1 成功構建pDC315-LUC-IZs-Green穿梭質(zhì)粒57-58
• 4.2 穿梭載體的瞬時轉染58-59
• 4.3 成功構建重組腺病毒59-61
• 4.4 重組腺病毒的鑒定61-65
• 4.5 測定普通棉耳狨猴體內(nèi)Ad5中和抗體水平65-69
• 4.6 統(tǒng)計學分析69-70
• 5 討論70-73
• 總結73-74
• 參考文獻74-82
• 縮略詞表82-83
• 攻讀學位期間成果83-84
• 致謝84-86

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本文編號：512921