本文關(guān)鍵詞：CD36對LPS誘導(dǎo)的自噬和炎癥因子的影響及分子機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:革蘭陰性菌內(nèi)毒素—脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是其細胞壁結(jié)構(gòu)組分,當(dāng)細菌死亡裂解時游離出來發(fā)揮毒性作用。CD36作為一種模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)可介導(dǎo)細胞識別LPS等多種抗原,由于其特殊的跨膜結(jié)構(gòu),還具有介導(dǎo)信號通路和調(diào)節(jié)細胞功能等作用;CD36的泛素化能快速調(diào)節(jié)其在細胞膜上的含量并影響其自身功能,因此藉用CD36泛素化位點的突變可考察泛素化對其功能的影響。巨噬細胞(macrophage)是機體重要的免疫細胞,也是炎癥反應(yīng)的主要參與者。LPS能有效地誘導(dǎo)巨噬細胞分泌TNF-α和IL-6等炎癥因子,亦可誘導(dǎo)細胞自噬等反應(yīng)參與抗感染免疫。CD36作為一種重要的PRR,在巨噬細胞中亦有豐富的表達,而對其在LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞自噬和炎癥因子分泌中的影響及分子機制研究甚少;CD36泛素化對其介導(dǎo)的信號通路和細胞功能有何影響尚待研究。野生型中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)無CD36的天然表達,同時該細胞還具有高擴增和表達特點,因此本課題第一部分以LPS與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、野生型cd36基因和泛素化位點突變cd36基因的CHO細胞(CHO/Vector、CHO/CD36 WT和CHO/CD36 K/A)共作用,探討CD36及其泛素化對LPS誘導(dǎo)的絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)信號通路和自噬的影響。第二部分首先利用si RNA和ERK抑制劑干預(yù)手段處理鼠源巨噬細胞RAW264.7,通過建立LPS與不同條件預(yù)處理的巨噬細胞RAW264.7共作用為細胞模型,研究巨噬細胞中CD36對LPS誘導(dǎo)的自噬和炎癥因子分泌的影響及分子機制,為闡明CD36對LPS誘導(dǎo)的自噬和炎癥因子分泌的影響及分子機制提供理論和實驗依據(jù)。方法:一、CD36及其泛素化對MAPK信號通路及自噬的影響1.LPS與CHO細胞共作用適宜濃度和時間的確定本實驗分別以0、5、10、20、50、100、200、500、1000 ng/ml LPS與CHO/CD36WT細胞共作用相同時間后收集細胞;進而將100 ng/ml LPS與CHO/CD36 WT細胞分別共作用0、10、30、60、120、240 min后收集細胞。采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(western blot,WB)檢測上述所收集細胞中ERK磷酸化水平,以確定LPS與CHO細胞共作用適宜的濃度和時間。2.CD36及其泛素化對MAPK信號通路的影響MAPK信號通路參與細胞中多種生理病理過程并發(fā)揮著重要作用。在MAPK家族中細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38是研究最廣泛和最重要的蛋白激酶,其磷酸化水平高低決定了其活性程度。實驗分別設(shè)置LPS與CHO/Vector、CHO/CD36 WT和CHO/CD36 K/A細胞共作用的組份及相應(yīng)的未加LPS作用的陰性對照組,共6組。根據(jù)上述實驗確定的LPS工作條件,以100 ng/ml LPS作用細胞2 h后,WB檢測ERK、JNK和p38磷酸化水平,即ERK、JNK和p38的活性。3.CD36及其泛素化對LPS誘導(dǎo)自噬的影響蛋白激酶C(protein kinases C,PKC)在自噬過程中的作用具有保守性,且甘油二酯(diacylglycerol,DAG)與其亞基上的C1位點結(jié)合直接影響其功能發(fā)揮;GFP-PKC-C1質(zhì)粒表達的蛋白以彌散形式存在細胞中,與DAG結(jié)合后會以點狀聚集物的形式存在,因此結(jié)合了DAG的GFP-PKC-C1表達蛋白形成的綠色點狀聚集物可顯示細胞中DAG的情況。將帶有紅色熒光的RFP-LC3質(zhì)粒和帶有綠色熒光的GFP-PKC-C1質(zhì)粒共同導(dǎo)入CHO/Vector、CHO/CD36 WT和CHO/CD36 K/A細胞中,并設(shè)置LPS作用組和LPS未作用的陰性對照組,LPS與細胞共作用2 h后,用共聚焦激光掃描顯微鏡(confocol laser scanning microscope,CLSM)觀察各組細胞中自噬體和DAG的共定位情況。二、巨噬細胞CD36對LPS誘導(dǎo)的自噬和炎癥因子的影響及分子機制研究1.LPS與RAW264.7細胞共作用濃度和時間的確定以含有0、5、10、20、50、100、500、1000 ng/ml LPS的培養(yǎng)液作用RAW264.7細胞相同時間后收集細胞;再分別收集100 ng/ml LPS與RAW264.7細胞共作用0、0.5、1、2、4、8、16、24 h的細胞,WB檢測自噬標(biāo)志蛋白:微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,MAP1-LC3-Ⅱ)的表達,以確定LPS與RAW264.7細胞共作用時適宜的濃度和時間。2.LPS對RAW264.7細胞中MAPK活性及自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表達的影響分別設(shè)置LPS與RAW264.7細胞共作用組和LPS未作用的陰性對照組。用上述方法確定的LPS工作條件,將100 ng/ml LPS與細胞共作用16 h后收集細胞,WB檢測ERK、JNK和p38磷酸化水平,自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達。3.巨噬細胞CD36對LPS誘導(dǎo)的ERK活性、自噬及炎癥因子的影響利用si RNA干擾巨噬細胞中CD36的表達,再用LPS作用正常細胞和si RNA干擾的細胞,同時設(shè)置未被LPS作用的正常細胞和si RNA干擾的細胞組份,共4組。LPS作用16 h后收獲細胞:①WB檢測ERK磷酸化水平、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達;②免疫熒光法檢測細胞中自噬體即LC3點狀聚集物的含量變化。同時,收集LPS作用16 h后的培養(yǎng)基上清液,酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測其中的細胞因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)。4.ERK抑制劑對LPS誘導(dǎo)的自噬及炎癥因子的影響首先用0、5、10、20、50、100 n M ERK抑制劑(PD 0325901)作用細胞24 h后,WB檢測ERK磷酸化水平,并用噻唑藍還原法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)測定細胞存活率,以確定ERK抑制劑的工作濃度。為進一步探討ERK活性對自噬及炎癥因子的影響,建立ERK抑制劑干預(yù)細胞模型,即陰性對照組、ERK抑制劑干預(yù)組、LPS作用組和LPS作用ERK抑制劑干預(yù)組,LPS作用16 h后收集細胞和培養(yǎng)基上清液,檢測指標(biāo)和方法同3。結(jié)果:一、CD36及其泛素化對MAPK信號通路及自噬的影響1.LPS與CHO細胞共作用適宜濃度和時間的確定:WB結(jié)果顯示,在不同濃度LPS作用CHO/CD36 WT細胞后,100 ng/ml LPS作用下的ERK磷酸化水平達到最高。與其他時間點相比,100 ng/ml LPS作用細胞2 h后ERK磷酸化水平達到最高。綜上所述,將100 ng/ml LPS作用CHO細胞2 h作為后續(xù)實驗條件。2.CD36及其泛素化對MAPK信號通路的影響:以上述實驗條件,LPS分別作用CHO/Vector、CHO/CD36 WT和CHO/CD36 K/A三株細胞。WB結(jié)果顯示,LPS作用CHO/CD36 WT細胞后,p ERK/t ERK值和p JNK/t JNK值顯著升高,即ERK和JNK活性顯著增高,p38的活性無明顯變化;而LPS與CHO/Vector細胞和CHO/CD36 K/A細胞共作用后,ERK、JNK和p38活性均無明顯變化。3.CD36及其泛素化對LPS誘導(dǎo)的自噬的影響:RFP-LC3和GFP-PKC-C1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至CHO/Vector、CHO/CD36 WT和CHO/CD36 K/A細胞后,CLSM結(jié)果顯示,LPS分別與CHO/CD36 WT細胞和CHO/CD36 K/A細胞共作用后,細胞中紅色點狀聚集物和黃色點狀聚集物數(shù)量明顯高于未加LPS作用的陰性對照組;也顯著高于LPS作用的CHO/Vector細胞;而LPS作用的CHO/CD36 WT細胞與LPS作用的CHO/CD36 K/A細胞相比,細胞中的紅色和黃色點狀聚集物數(shù)量未見顯著差異。二、巨噬細胞CD36對LPS誘導(dǎo)的自噬和炎癥因子的影響及分子機制研究1.LPS與RAW264.7細胞共作用濃度和時間的確定:WB結(jié)果顯示,100 ng/ml LPS作用細胞后,LC3-Ⅱ表達水平升高并已達到峰值。以100 ng/ml LPS作用細胞不同時間,隨作用時間的延長,細胞中LC3-Ⅱ表達水平逐漸升高,在16 h時LC3-Ⅱ表達水平達到峰值。結(jié)合參考文獻和實驗結(jié)果,將100 ng/ml LPS作用RAW264.7細胞16 h作為后續(xù)實驗條件。2.LPS對RAW264.7細胞中MAPK活性及LC3-Ⅱ和Beclin-1表達的影響:以上述實驗條件,將100 ng/ml LPS作用RAW264.7細胞16 h,收集細胞。WB結(jié)果顯示,與LPS未作用的陰性對照組相比,p ERK/t ERK值和p JNK/t JNK值在LPS作用后升高,即ERK和JNK活性增高;而p38的活性無明顯變化;LC3-Ⅱ/Tubulin值和Beclin-1/Tubulin值顯著升高。3.巨噬細胞CD36對LPS誘導(dǎo)的ERK活性、自噬及炎癥因子的影響:WB檢測CD36、ERK磷酸化水平及自噬蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CD36表達水平高的正常巨噬細胞在LPS作用后,ERK活性顯著升高,LC3-Ⅱ/Tubulin值及Beclin-1/Tubulin值升高;LPS作用CD36 si RNA預(yù)處理的細胞,CD36表達顯著下降,ERK活性降低,LC3-Ⅱ/Tubulin值及Beclin-1/Tubulin值卻進一步升高。CLSM結(jié)果顯示,LPS作用的巨噬細胞中綠色點狀聚集物數(shù)量高于陰性對照組;當(dāng)下調(diào)CD36表達時,LPS誘導(dǎo)細胞中綠色點狀聚集物數(shù)量仍進一步升高。ELISA結(jié)果顯示,LPS作用下細胞分泌TNF-α和IL-6水平顯著升高,而IL-10分泌水平無顯著差異;CD36表達下降導(dǎo)致細胞TNF-α和IL-6分泌水平下降,而IL-10分泌水平明顯升高。4.ERK抑制劑對LPS誘導(dǎo)的自噬及炎癥因子的影響:MTT結(jié)果顯示,在不高于20 n M濃度的ERK抑制劑作用下,細胞存活率均超過50%。WB結(jié)果發(fā)現(xiàn),在20 n M和50 n M ERK抑制劑作用下,細胞中ERK活性最小,抑制效果最好。綜上所述,將20 n M作為ERK抑制劑的工作濃度干預(yù)細胞。WB結(jié)果顯示,LPS作用下細胞中ERK活性明顯升高,LC3-Ⅱ/GAPDH值及Beclin-1/GAPDH值升高;進而用20 n M ERK抑制劑干預(yù)細胞發(fā)現(xiàn),ERK活性明顯下降,而LPS作用后LC3-Ⅱ/GAPDH值進一步升高。CLSM結(jié)果顯示,LPS作用下細胞中的綠色點狀聚集物數(shù)量高于陰性對照組;ERK抑制劑干預(yù)細胞ERK活性后,LPS誘導(dǎo)細胞中綠色點狀聚集物數(shù)量進一步升高。ELISA檢測結(jié)果顯示,ERK抑制劑的干預(yù)能使LPS誘導(dǎo)的TNF-α分泌水平顯著下降,IL-6的分泌水平下降,而IL-10分泌水平升高。結(jié)論:1.LPS與CHO細胞共作用后發(fā)現(xiàn),CD36介導(dǎo)細胞中ERK和JNK的活化,且在介導(dǎo)LPS誘導(dǎo)的自噬過程中是必不可少的;CD36泛素化位點突變后,LPS所致的ERK和JNK的活化與陰性對照相比未見明顯差異;CLSM結(jié)果顯示,泛素化位點的突變未見對CD36介導(dǎo)DAG相關(guān)自噬體形成的明顯變化,但對CD36泛素化是否影響自噬的確切機制還有待進一步研究。2.在巨噬細胞中,ERK信號通路參與了LPS誘導(dǎo)的自噬和炎癥因子釋放過程。CD36通過ERK信號通路負向調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的自噬和抑炎因子的釋放,正向調(diào)節(jié)促炎因子的釋放。
【關(guān)鍵詞】：CD36 ERK信號通路 LPS 炎癥因子 自噬
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要4-9
• abstract9-16
• 引言16-19
• 第一部分CD36 及其泛素化對MAPK信號通路及自噬的影響19-31
• 1 材料與方法19-25
• 2 結(jié)果25-29
• 3 討論29-31
• 第二部分 巨噬細胞CD36 對LPS誘導(dǎo)的自噬和炎癥因子的影響及分子機制研究31-49
• 1 材料與方法32-37
• 2 結(jié)果37-46
• 3 討論46-49
• 小結(jié)49-50
• 參考文獻50-55
• 綜述 清道夫受體與病原體感染相互作用的研究進展55-65
• 參考文獻61-65
• 攻讀學(xué)位期間已發(fā)表和待發(fā)表的論文65-66
• 本課題所獲基金資助66-67
• 英文縮略詞表67-69
• 致謝69-71

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