本文關(guān)鍵詞：FADD磷酸化在其非凋亡功能中的作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：具有死亡功能區(qū)的Fas相關(guān)蛋白(Fas-associating protein with a novel death domain,FADD),最早是作為凋亡過程中的銜接蛋白被人們所熟知。隨著研究的進(jìn)一步深入,發(fā)現(xiàn)FADD也參與了多種非凋亡有關(guān)的細(xì)胞進(jìn)程。南京大學(xué)華子春課題組圍繞FADD的新生物學(xué)功能取得了多項研究進(jìn)展。在此基礎(chǔ)上,本文以構(gòu)建6種過表達(dá)載體為起點,以果蠅作為模式動物,采用標(biāo)準(zhǔn)的顯微注射技術(shù),構(gòu)建轉(zhuǎn)基因果蠅模型,并進(jìn)一步研究磷酸化FADD的非凋亡功能。首先,構(gòu)建老鼠全長的FADD (mFADD)、持續(xù)磷酸化mFADD (S191D)、持續(xù)非磷酸化mFADD(S191A)、C末端敲除的mFADD、BG4、及選擇標(biāo)記c-myc(對照)6種過表達(dá)載體,我們根據(jù)鼠FADD基因序列并利用重疊延伸PCR定點突變方法,獲得磷酸化mFADD、非磷酸化mFADD、C末端敲除的mFADD及序列正確的BG4。將各形式的FADD片段通過PCR擴(kuò)增后,連接到載體pUASTattB中。其次,采取標(biāo)準(zhǔn)的顯微注射技術(shù),注射24872(2號染色體定點突變)果蠅胚胎,以橘黃眼或紅眼為轉(zhuǎn)基因的標(biāo)記表現(xiàn)型,獲得過表達(dá)mFADD、C末端敲除、pFADD、npFADD、BG4、c-myc的轉(zhuǎn)基因果蠅。第三,制備dFADD基因敲除果蠅,利用CRISPR/Cas9技術(shù),采取標(biāo)準(zhǔn)的顯微注射技術(shù),注射到果蠅54591(持續(xù)表達(dá)Cas9的轉(zhuǎn)基因果蠅)胚胎中,待幼蟲羽化后逐個逐代進(jìn)行雜交鑒定。第四,分析上述六種過表達(dá)轉(zhuǎn)基因果蠅的遺傳性狀：(1)轉(zhuǎn)基因果蠅遺傳表型分析：對眼睛及翅膀表型分析,結(jié)果顯示部分FADD-D果蠅翅膀出現(xiàn)卷曲現(xiàn)象,但對果蠅眼睛并沒有明顯的影響。(2)對細(xì)胞周期的影響：檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinE mRNA的表達(dá)情況,觀察是否發(fā)生表達(dá)紊亂；(3)天然免疫中的作用分析：檢測參與Imd途徑的Dredd蛋白mRNA的表達(dá)水平；(4)糖代謝相關(guān)酶的表達(dá)變化：檢測果蠅中糖代謝相關(guān)酶G6pc、Pepck mRNA的表達(dá)變化；(5)攀爬、壽命分析：統(tǒng)計結(jié)果表明,FADD-D果蠅攀爬能力下降、壽命變短,并且各轉(zhuǎn)基因果蠅攀爬能力及壽命較對照組都有明顯下降趨勢；最后,獲得在dFADD knock down(RNAi)的基礎(chǔ)上,過表達(dá)FADD的轉(zhuǎn)基因果蠅：分別將dFADD knock down的果蠅、各種過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因果蠅與含雙平衡子工具果蠅雜交。根據(jù)平衡子的表型特征,挑選子一代果蠅,將子一代雜交得到子二代果蠅,從而獲得我們預(yù)期的轉(zhuǎn)基因果蠅。綜合以上研究結(jié)果,我們認(rèn)為FADD磷酸化對果蠅的壽命及運(yùn)動能力產(chǎn)生影響。
【關(guān)鍵詞】：黑腹果蠅 轉(zhuǎn)基因果蠅 FADD磷酸化 非凋亡功能
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 主要縮略詞表10-11
• 緒言11-13
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述13-25
• 一、FADD及其凋亡功能13-14
• 二、FADD磷酸化的非凋亡功能研究進(jìn)展14-24
• 小結(jié)24-25
• 第二部分 實驗材料與方法25-45
• 一、實驗材料25-30
• 二、實驗方法30-45
• 第三部分 實驗結(jié)果與討論45-65
• 第一章 FADD過表達(dá)轉(zhuǎn)基因模型的建立45-53
• 前言45-47
• 結(jié)果47-52
• 討論52-53
• 第二章 CRISPR/Cas9基因敲除FADD果蠅模型的建立53-58
• 前言53-54
• 結(jié)果54-58
• 第三章 FADD過表達(dá)果蠅模型遺傳性狀的初步分析58-65
• 前言58
• 結(jié)果58-63
• 討論63-65
• 結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-71
• 致謝71-72
• 作者簡介72

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