本文關(guān)鍵詞：基于解剖學(xué)分區(qū)的人類胃黏膜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:繪制人類第一張基于解剖學(xué)分區(qū)的正常胃粘膜高分辨率蛋白表達譜,建立胃粘膜蛋白表達的數(shù)據(jù)庫;結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計學(xué)描繪各個解剖分區(qū)的蛋白表達豐度的正常參考值范圍,探究各個解剖學(xué)分區(qū)的功能差異,為胃癌等胃粘膜相關(guān)疾病的診斷與治療的研究奠定了基礎(chǔ)。方法:通過引進和建立的sRP技術(shù),聯(lián)合高通量質(zhì)譜分析平臺,結(jié)合實驗室開發(fā)的一站式蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析Firmiana等技術(shù)平臺,從而建立了一整套完整的從臨床樣本收集與處理到質(zhì)譜檢測與生物信息學(xué)分析的研究方案。胃粘膜按解剖學(xué)分為賁門、胃底、小彎、大彎、胃角、胃竇和幽門等7個分區(qū),使用該方案每個分區(qū)分別檢測了10例樣本,共測定了70例胃黏膜組織樣本的全蛋白表達譜。采用基于峰面積的無標(biāo)定量(intensity based absolute quantification,iBAQ)方法來表征蛋白的表達水平,然后再對數(shù)據(jù)進行歸一化處理:鑒定的每個蛋白與鑒定到的所有蛋白的定量比值,去除質(zhì)譜檢測時上樣量等因素造成的誤差。采用Bootstrap方法估計小樣本(n10)時每個解剖學(xué)分區(qū)的蛋白表達水平的差異。使用Shapiro-Wilk統(tǒng)計學(xué)方法計算胃黏膜數(shù)據(jù)的分布情況,根據(jù)數(shù)據(jù)的分布情況進一步計算各個解剖分區(qū)的蛋白表達豐度的正常參考值范圍。差異蛋白(過表達)蛋白(Region enriched proteins,REP)的篩選按照該解剖分區(qū)與其他六個分區(qū)的數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學(xué)上有差異(P0.05),符合正態(tài)分布的利用t檢驗,不符合正態(tài)分布的采用WMW檢驗計算統(tǒng)計學(xué)差異。進一步采用Pearson相關(guān)分析,評價各個解剖學(xué)分區(qū)的差異蛋白在不同分區(qū)之間的相關(guān)性。結(jié)果:基于先進的樣本預(yù)處理技術(shù)與高通量質(zhì)譜檢測方法,組織蛋白的鑒定數(shù)目從文獻報道的4000左右的水平提高到6000左右,大大提高了胃黏膜蛋白鑒定覆蓋的深度;同時將質(zhì)譜分析一例組織樣本質(zhì)譜分析的時間由3-4d縮短到10h以內(nèi),極大地提高了質(zhì)譜分析的效率。在肽段和基因產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)錯誤率(false discovery rate,FDR)小于1%時,70例胃黏膜組織樣本共鑒定到了9875個蛋白,7個解剖學(xué)分區(qū)都鑒定到的蛋白數(shù)目也達到了6375。通過無標(biāo)定量技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)微量胃粘膜組織的蛋白質(zhì)組已經(jīng)覆蓋了108的波動范圍。轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶在生物體內(nèi)的表達量一般都很低,通常要經(jīng)過富集過程的處理才能鑒定到,但是在本研究中仍然鑒定到了719個轉(zhuǎn)錄因子和激酶;如轉(zhuǎn)錄因子核糖核苷酸聚合酶I(Upstream Binding Transcription Factor,RNA Polymerase I,UBTF)的表達量只有管家蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase,gapdh)的1/200,而蛋白激酶磷酸肌醇-3-激酶的調(diào)節(jié)亞型(phosphoinositide-3-kinase,regulatorysubunit4,pik3r4)的表達量更少,只有g(shù)apdh的1/1000。綜上可知,本研究已經(jīng)達到了深度覆蓋的胃粘膜蛋白質(zhì)組學(xué)分析的水平。本研究與轉(zhuǎn)錄組ebi-ae數(shù)據(jù)庫對比,鑒定到了其中65.3%的基因產(chǎn)物(即9167個蛋白),新發(fā)現(xiàn)了692個表達蛋白,是對轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的重要補充,為這些基因的研究提供了蛋白水平上的證據(jù);通過定量水平的相關(guān)分析,整體上所有相同基因的蛋白表達水平與轉(zhuǎn)錄水平之間的相關(guān)系數(shù)r2為0.32。在基因水平上,除了y染色體之外,每條染色體上的基因表達比例均在30%-40%之間,而與解剖學(xué)分區(qū)并沒有明顯的關(guān)聯(lián)。采用bootstrap方法估計每個解剖分區(qū)蛋白表達水平的變異。隨著抽樣例數(shù)的增加,每個解剖分區(qū)的變異系數(shù)的變異系數(shù)逐漸變小且趨于穩(wěn)定,當(dāng)抽樣例數(shù)為8-10時,變異系數(shù)的變異系數(shù)幾乎均在0.7左右,這說明了每個分區(qū)測定10例樣本時,整體上胃粘膜蛋白的表達水平已經(jīng)比較穩(wěn)定,即10例樣本就足以代表每個解剖分區(qū)的蛋白表達情況。在七個分區(qū)中,有些胃粘膜蛋白在各個解剖分區(qū)上的表達情況差異很小,而另一些蛋白的表達差異卻非常大。如管家蛋白gapdh在7個分區(qū)的表達量都很高;而促進胃酸分泌的胃泌素蛋白(gastrin,gast)在胃角、胃竇和幽門的表達量明顯高于其他四個解剖學(xué)分區(qū);而人類表皮生長因子受體2(erb-b2receptortyrosinekinase2,erbb2)在胃角、胃竇和幽門的表達量較高,但總體表達量遠遠低于管家蛋白gapdh和胃泌素蛋白。通過對胃黏膜7個分區(qū)全部蛋白的表達情況分析發(fā)現(xiàn),表達的蛋白在整體胃上符合正態(tài)分布的數(shù)目很少,只有392個蛋白,而在同一個分區(qū)內(nèi)的表達蛋白符合正態(tài)分布的數(shù)目約為3000左右,提示胃粘膜蛋白在整體胃上表達的差異可能較大,而在同一個分區(qū)的差異則相對較小。根據(jù)各個區(qū)的分布特點,分別計算每個分區(qū)蛋白表達豐度的正常參考值范圍,符合正態(tài)分布的蛋白以平均值和95%的置信區(qū)間(μ-1.96σ,μ-1.96σ)表示,不符合正態(tài)分布的蛋白則以非零數(shù)值的中位數(shù)和極值表示(min,max)。在數(shù)據(jù)整體分布特點的基礎(chǔ)上,合理運用t檢驗和wmw檢驗等統(tǒng)計學(xué)檢驗方法,結(jié)合基因表達上調(diào)2倍以上及表達頻率篩選各個解剖分區(qū)的差異蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小彎的差異蛋白最少,但卻是該分區(qū)所特有的;胃竇與幽門部的差異蛋白較多,但相互之間共有的差異蛋白也較多,提示胃竇幽門部的功能可能相對較為復(fù)雜或具有一些獨特的生物學(xué)功能。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),賁門、胃底、大彎和小彎之間的相關(guān)系數(shù)均在0.95以上,胃角、胃竇和幽門之間的相關(guān)系數(shù)也在0.9左右,但近端胃與遠端胃的相關(guān)性不高,相關(guān)系數(shù)都在0.4以下。差異蛋白的GO注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)各個解剖學(xué)分區(qū)在功能上是存在差異的,尤其是近端胃與遠端胃的功能差異更加明顯,幽門還較多的參與免疫等生物學(xué)過程。同樣,轉(zhuǎn)錄因子與激酶的KEGG pathway分析也主要提示了近端胃與遠端胃在功能上的差異,主要是遠端胃參與了相關(guān)的免疫過程。結(jié)論:采用簡單、高效的sRP預(yù)分離技術(shù)聯(lián)合高通量質(zhì)譜檢測平臺,成功描繪了人類第一張基于解剖學(xué)分區(qū)的正常胃粘膜高分辨率蛋白表達譜,并建立了胃黏膜的蛋白表達數(shù)據(jù)庫,確定了正常胃粘膜蛋白表達豐度的正常參考值范圍;同時發(fā)現(xiàn)各個解剖分區(qū)的蛋白表達水平存在一定差異,尤其是近端胃與遠端胃之間的差異更加明顯。為以后胃癌等胃黏膜相關(guān)疾病的診斷與治療的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：蛋白表達譜 胃黏膜 解剖學(xué)分區(qū) 參考值范圍 差異蛋白
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R322.44
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 1.前言12-16
• 2.材料與方法16-20
• 2.1 研究對象16
• 2.2 主要試劑與儀器16
• 2.3 實驗流程與步驟16-18
• 2.3.1 蛋白的提取及還原烷基化16
• 2.3.2 溶液內(nèi)酶解及肽段萃取16-17
• 2.3.3 sRP預(yù)分離微柱的制作17
• 2.3.4 sRP柱梯度分離肽段17-18
• 2.3.5 Orbitrap Fusion質(zhì)譜分析18
• 2.3.6 蛋白的搜庫與鑒定18
• 2.4 數(shù)據(jù)分析軟件與方法18-20
• 3.結(jié)果20-31
• 3.1 sRP技術(shù)的分離效果20-21
• 3.2 胃黏膜蛋白質(zhì)組學(xué)21-22
• 3.3 蛋白質(zhì)組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)22-24
• 3.4 Bootstrap方法評價胃黏膜蛋白表達的差異24-25
• 3.5 正常參考值范圍的確定25-26
• 3.6 差異蛋白的篩選與分析26-28
• 3.7 胃酸分泌過程的蛋白表達分析28-29
• 3.8 轉(zhuǎn)錄因子與激酶29-31
• 4.討論31-34
• 5.結(jié)論34-35
• 參考文獻35-38
• 附錄38-51
• 附錄一.胃黏膜表達蛋白的正常參考值范圍（Top100）38-42
• 附錄二.胃黏膜差異表達蛋白的GO注釋結(jié)果42-51
• 論著51-59
• 個人簡歷59-60
• 致謝60

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  本文關(guān)鍵詞：基于解剖學(xué)分區(qū)的人類胃黏膜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：472719