本文關鍵詞：細胞黏附蛋白的篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人的大腦是人體最重要的器官之一,由數(shù)目巨大的神經(jīng)元組成。神經(jīng)元之間通過彼此相互接觸完成信息的傳遞,從而實現(xiàn)接受刺激、傳導興奮的功能。神經(jīng)元之間的信息傳遞是通過突觸來完成的。突觸是實現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)功能的基本結構單位。據(jù)統(tǒng)計,人體大腦中大約有1015個突觸。突觸由突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜組成。其中,突觸間隙大約有20納米,上面有各種功能各異的蛋白和碳水化合物分子,具有非常復雜的結構。突觸間隙最重要的功能就是通過突觸間隙上的蛋白質之間的相互作用,將突觸前膜和突觸后膜“粘連”起來,完成神經(jīng)元之間的信息傳遞。這種蛋白我們稱之為:細胞黏附蛋白。細胞黏附蛋白由三部分組成:與細胞骨架蛋白相連接的胞內(nèi)結構域,跨膜結構域和與其它細胞黏附蛋白相互作用的胞外結構域。大多數(shù)細胞黏附蛋白位于突觸中央,也有一些位于突觸前膜和突觸后膜反應區(qū)的邊緣上。細胞黏附蛋白具有識別突觸前膜和突觸后膜的作用位點,傳導神經(jīng)信號,協(xié)助釋放突觸囊泡的功能。同時,細胞黏附蛋白分子對于突觸的形成,成熟,分化,以及維持神經(jīng)遞質受體和離子通道的正常數(shù)量也起著至關重要的作用。突觸細胞黏附蛋白的異常表達會導致各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前,人類在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病率日益上升,已經(jīng)成為威脅人類身體健康的最可怕的殺手之一。找到更多的細胞黏附蛋白并加強對其功能的研究,對于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病有著重要的意義。雖然發(fā)現(xiàn)了一些細胞黏附蛋白,但是與數(shù)目眾多、種類各異的突觸相比,我們知道的僅僅是冰山一角。有研究表明:細胞黏附蛋白在非神經(jīng)元細胞上表達可誘發(fā)神經(jīng)突觸的聚集。缺失一種細胞黏附蛋白可能不會導致突觸無法形成,但是卻可以影響突觸的結構和功能,甚至會導致神經(jīng)系統(tǒng)疾病。基于上述結論,我們將神經(jīng)細胞和非神經(jīng)細胞共培養(yǎng)篩選出能誘發(fā)突觸聚集的基因;通過基因的過表達或敲除實驗對其功能進行研究從而發(fā)現(xiàn)細胞黏附蛋白。利用該方法可以發(fā)現(xiàn)更多的細胞黏附蛋白。我們對麻省理工大學Broad研究所和哈佛等著名高等院校研究所研發(fā)的最新的CCSB-Broad慢病毒表達文庫進行了篩選。該文庫是在該組織早先開發(fā)的ORFeome8.1文庫的基礎上,通過Gateway克隆的LR反應技術將目的基因轉移到p LX304-Blast-V5載體上得到的。Gateway克隆技術是目前最先進的克隆技術之一,具有高效,快速,靈活的優(yōu)點。由于CCSB-Broad慢病毒表達文庫中缺少222個大小在3Kb以上的基因,因此在正式篩選前我們也采用Gateway克隆技術中的LR反應將缺少的目的質粒轉移到p CDNA3.2v5-DEST載體上。LR反應是在Xis、IHF和Int等重組因子組成的LR重組酶混合物(LR Clonase?enzyme mix)的作用下將入門載體(Entry Clone)上的目的質粒ORF(open reading frame)與目的載體p CDNA3.2v5-DEST上的致死基因ccd B基因互換,得到p CDNA3.2v5-DEST載體上含有目的質粒的克隆產(chǎn)物的過程。酶切反應采用的是限制性內(nèi)切酶Bgl II.只用一種限制性內(nèi)切酶鑒定可以節(jié)約時間和成本。經(jīng)過酶切驗證,得到所有克隆正確的質粒。由于不能確定所有的LR克隆產(chǎn)物全都表達膜蛋白,在蛋白印跡實驗中,驗證的樣品采用全蛋白。實驗發(fā)現(xiàn):對3.5厘米培養(yǎng)皿培養(yǎng)的HEK293T細胞來說,轉染質粒在4微克可以達到最佳的轉染效率。目前有110個LR克隆基因可以表達蛋白。通過LR克隆反應,我們得到幾乎所有的人類基因,共有16394種,可以對人類全基因進行全面的篩選。本實驗形成一套穩(wěn)定的篩選方法。將1.5微克目的質粒和0.5微克GFP-FUGW質粒通過聚乙烯亞胺(PEI)轉染到人源胚胎腎變種細胞(HEK293T)中培養(yǎng)24小時后加入培養(yǎng)九天的海馬神經(jīng)元中共同培養(yǎng)。36小時后免疫熒光染色再用高內(nèi)涵細胞成像分析系統(tǒng)進行處理,如果目的質粒表達的蛋白為細胞黏附蛋白,就會誘導突觸在HEK293T細胞周圍聚集。實驗中發(fā)現(xiàn),轉染0.25微克陽性質粒就可以引起明顯的突觸聚集現(xiàn)象。因此,本實驗創(chuàng)新的將6中不同的質粒等濃度混合,再轉染1.5微克混合質粒到HEK293T細胞中進行篩選。在達到篩選目的同時也節(jié)省了大量的時間和經(jīng)費。實驗用突觸聚集熒光強度與周圍突觸熒光強度的比值來量化突觸聚集程度,即Coculture Index(C.I.)值。C.I.1時可以觀察到突觸聚集現(xiàn)象。實驗發(fā)現(xiàn),突觸聚集區(qū)域在HEK293T細胞邊緣向內(nèi)2微米,向外2微米得到的C.I.值較好。目前,實驗篩選得到4個陽性混合質粒可能參與突觸形成。
【關鍵詞】：神經(jīng) 突觸形成 細胞黏附蛋白 LR克隆 共培養(yǎng)
【學位授予單位】：中南民族大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R338
【目錄】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 第一章 緒論12-19
• 1.1 細胞黏附蛋白的研究現(xiàn)狀13-15
• 1.2 研究方法15-18
• 1.3 研究的目的和意義18-19
• 第二章 LR克隆技術及其克隆質粒的驗證19-36
• 2.1 引言19
• 2.2 GATEWAY克隆技術簡介19-21
• 2.3 實驗方法21-31
• 2.3.1 LR克隆反應21-23
• 2.3.2 大腸桿菌擴大培養(yǎng)和質粒小提23-24
• 2.3.3 酶切和瓊脂糖凝膠電泳驗證24-26
• 2.3.4 蛋白驗證26-31
• 2.3.4.1 HEK293T細胞PEI轉染26-27
• 2.3.4.2 提取全蛋白27-28
• 2.3.4.3 蛋白質印跡法28-31
• 2.4 實驗結果31-34
• 2.4.1 酶切結果31-32
• 2.4.2 蛋白印跡鑒定結果32-34
• 2.5 結果分析34-36
• 第三章 突觸后膜細胞黏附蛋白的篩選36-53
• 3.1 引言36
• 3.2 高內(nèi)涵細胞成像分析系統(tǒng)簡介36-37
• 3.3 實驗方法37-42
• 3.3.1 乳鼠海馬組織神經(jīng)細胞培養(yǎng)37-39
• 3.3.1.1 乳鼠海馬組織神經(jīng)元提取37-38
• 3.3.1.2 第一天神經(jīng)細胞換神經(jīng)元生長培養(yǎng)液38
• 3.3.1.3 第四天神經(jīng)細胞換含4微摩爾阿糖胞苷的神經(jīng)元培養(yǎng)液38-39
• 3.3.1.4 第九天神經(jīng)細胞換含4微摩爾阿糖胞苷的神經(jīng)元培養(yǎng)液39
• 3.3.2 HEK293T細胞轉染39-40
• 3.3.2.1 第七天實驗用HEK293T細胞培養(yǎng)39-40
• 3.3.2.2 第八天HEK293T細胞PEI轉染40
• 3.3.3 第九天共培養(yǎng)40-41
• 3.3.4 第十一天突觸免疫熒光染色41-42
• 3.4 實驗結果42-51
• 3.4.1 HEK293T細胞過量表達NL2也可以引起突觸聚集42-43
• 3.4.2 C.I.計算方法統(tǒng)計突觸聚集程度43-44
• 3.4.3 高內(nèi)涵細胞成像系統(tǒng)圖像采集44-45
• 3.4.4 細胞共培養(yǎng)時間分析45
• 3.4.5 轉染質粒質量分析45-47
• 3.4.6 突觸蛋白篩選流程與結果分析47-50
• 3.4.7 X1可以引起突觸聚集現(xiàn)象50-51
• 3.4.8 X1突觸聚集數(shù)據(jù)分析51
• 3.5 結果分析51-53
• 第四章 結論與展望53-56
• 4.1 LR克隆及其驗證53-54
• 4.2 細胞黏附蛋白篩選54
• 4.3 展望54-56
• 參考文獻56-59
• 致謝59-60
• 附錄A 攻讀學位期間所發(fā)表的學術論文目錄60-61
• 附錄B 實驗所需試劑的配置方法61-64

  本文關鍵詞：細胞黏附蛋白的篩選，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：467868