本文關鍵詞：c-Met抑制劑17-AAG和卡博替尼對小鼠體內(nèi)產(chǎn)單核細胞李斯特菌感染的阻斷作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景產(chǎn)單核細胞李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM,簡稱李斯特菌)是一種可寄生于細胞內(nèi)的兼性厭氧革蘭陽性菌,最早于1926年由Murray從患敗血癥的大鼠和兔子中分離得到,對環(huán)境的耐受性強,因而可廣泛存在于自然界不同的環(huán)境中,如土壤、植物、水源等處,容易污染肉、奶、海產(chǎn)品等食品。李斯特菌主要感染免疫功能低下患者,特別是孕婦以及老年人,可引起人或動物不同類型的李斯特菌病,如腦炎、腦膜腦炎、流產(chǎn)、敗血癥、肺炎、角膜炎等,其中嬰幼兒、孕婦以及免疫耐受患者的感染死亡率可高達20%-30%。2001年至今,我國檢驗檢疫部門已多次從美國、加拿大、法國等國家進口的奶酪及肉制品中檢出產(chǎn)單核細胞李斯特菌。李斯特菌病的臨床表現(xiàn)主要有腦膜腦炎型、敗血癥型、妊娠感染型、新生兒敗血性肉芽腫型,其中在非妊娠免疫力低下的成人中,腦膜腦炎型和敗血癥型最為常見。產(chǎn)單核細胞李斯特菌已被列為20世紀90年代四大食源性致病菌之一,是第二大能引起1歲以下和60歲以上老人中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原體,此外,李斯特菌也是引起發(fā)展中國家社區(qū)獲得性細菌性腦膜炎的主要致病菌之一。人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)李斯特菌病的臨床表現(xiàn)有多種,包括腦膜炎、腦干腦炎、脈絡叢腦膜炎。雖然抗生素能有效殺滅細菌,但包括李斯特菌病在內(nèi)的細胞內(nèi)細菌感染仍面臨著嚴峻的挑戰(zhàn),其主要的原因之一是大多數(shù)的抗生素無法殺滅進入細胞內(nèi)的病原菌,并且抗生素療法相對忽視了宿主的抗菌機制。因此,尋找新一代抗細胞內(nèi)細菌感染的藥物,是臨床治療李斯特菌病亟待解決的問題。c-Met是一種由c-met原癌基因編碼的蛋白產(chǎn)物,為間質(zhì)細胞來源的肝細胞生長因子／分散因子(human hepatocyte growth factor/scatter factor, HGF/SF)的受體,具有酪氨酸激酶活性,與多種癌基因產(chǎn)物和調(diào)節(jié)蛋白相關。病原微生物通過其自身攝入和轉(zhuǎn)運,穿越正常防御組織屏障而侵入宿主組織器官。但某些病原菌可進行生物模擬,模擬宿主受體相應的天然配體分子,這種現(xiàn)象,即所謂的“細菌直接的轉(zhuǎn)胞吞作用”,在細菌侵襲上皮和內(nèi)皮細胞中都可見到。產(chǎn)單核細胞李斯特菌可穿越宿主的三個屏障—腸屏障、血腦屏障和胎盤屏障,侵入機體后可以在專職和非專職吞噬細胞中生存和繁殖,其感染過程包括：內(nèi)化、逃離吞噬泡、李斯特菌在宿主細胞內(nèi)的極性運動與細胞間傳播。李斯特菌在黏附侵襲相關毒力因子的作用下,進入宿主細胞。內(nèi)化素(internalins)是其中一種重要的黏附侵襲相關毒力因子,能夠識別宿主細胞上的相關受體。內(nèi)化素A(InlA)、內(nèi)化素B(InlB)通過LRR結(jié)構域(亞單位)與特異性受體相結(jié)合,InlA與鈣黏蛋白結(jié)合,介導細菌進入上皮細胞；而InlB模擬天然配體肝細胞生長因子／分散因子,能與肝細胞生長因子／分散因子受體(c-Met)結(jié)合,介導細菌穿越肝細胞、成纖維細胞、上皮細胞等。InlB與脂筏上的c-Met結(jié)合,誘導Cb1、Gab1、Shc和Grb2蛋白的聚集,緊接著p85/p110 I家族PI-3激酶聚集,PI-3激酶將PI(4,5)P2(PIP2)轉(zhuǎn)換為PI (3,4,5) P3(PIP3),促使一種未知的蛋白聚集激活Rac, Rac間接激活LIM激酶,調(diào)控cofilin對肌動蛋白的聚合和解聚,介導李斯特菌內(nèi)化。因此,靶向InlB介導的侵襲過程,是探索特異性阻斷李斯特菌細胞內(nèi)感染的重要途徑。作為InlB受體, c-Met是阻斷李斯特菌感染的良好靶點。格爾德霉素(Geldanamycin, GA)為茴香霉素(Anisomycin)抗生素家族成員,是苯醌袢霉素家族的原型藥物,已證實格爾德霉素可以破壞癌細胞中的c-Met-GF/SF軸心,能特異性阻斷c-Met中酪氨酸磷酸化,是c-Met信號傳導通路的特異抑制劑。HGF/SF-c-Met通路與人類腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關,且在李斯特菌入侵宿主細胞過程中起重要作用。格爾德霉素對移植瘤表現(xiàn)出抗腫瘤活性,但其劑量依賴的致死性肝細胞毒性、胃腸道損傷和腎毒性,不適合作為藥物進一步研發(fā)。格爾德霉素類似物,如17-AAG和17-DMAG,能影響與腫瘤細胞增殖和存活有關的信號通路中的多個靶點,例如：能特異性阻斷c-Met中酪氨酸磷酸化和破壞熱休克蛋白Hsp90伴侶蛋白的功能,這些靶點與腫瘤發(fā)生和病原感染等多種病理生理功能改變相關。17-AAG和17-DMAG通過與格爾德霉素相同的機制發(fā)揮抗腫瘤作用,但比格爾德霉素有更高的血濃度和較小的肝臟毒性,是c-Met信號傳導通路的潛在抑制劑,可作為藥物研發(fā)�？ú┨婺�(Cabozantinib)是一種口服的多種受體酪氨酸激酶抑制劑,美國食品藥品管理局(FDA)已批準卡博替尼用于轉(zhuǎn)移性甲狀腺髓樣癌的治療。細胞和動物實驗已證實：卡博替尼能夠調(diào)節(jié)Met信號通路,從而抑制腫瘤細胞的增殖。近期臨床研究證明：卡博替尼能夠治療甲狀腺髓樣癌和前列腺癌,并且具有安全劑量范圍。本研究建立產(chǎn)單核細胞李斯特菌感染小鼠模型,通過比較小鼠生存曲線、細菌載量、血清IL-10和NF-κB p65含量、腦組織依文思藍含量以及腦組織病理變化,驗證c-Met抑制劑17-AAG和卡博替尼對李斯特菌體內(nèi)感染的阻斷作用,探討c-Met抑制劑作為李斯特菌感染治療藥物的可行性。目的通過小鼠動物體內(nèi)試驗,研究c-Met抑制劑17-AAG和卡博替尼對李斯特菌體內(nèi)感染的阻斷作用,探討c-Met抑制劑作為李斯特菌感染治療藥物的可行性,尋找細胞內(nèi)細菌感染的治療新策略。研究方法一、17-AAG對李斯特菌小鼠體內(nèi)感染的阻斷作用1、生存曲線分析將小鼠隨機分為4組：17-AAG組、氨芐青霉素組、17-AAG聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對照組,每組8只,每只小鼠腹腔注射1×106CFU李斯特菌,并分別在感染后6h、12h、24h給藥,分別腹腔注射17-AAG 5μg/g、腹腔注射氨芐青霉素20μg/g、腹腔注射17-AAG 5μg/g后腹腔注射20μg/g氨芐青霉素、以及腹腔注射等量PBS。每天記錄觀察小鼠的臨床癥狀和生存情況,共5d。2、血液、腦、肝、脾細菌計數(shù)(1)劑量依賴效應取24只小鼠,將小鼠隨機分為0、2μg/g、5μg/g、10μg/g17-AAG四種劑量組,每組6只。每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌,分別于給菌前2小時和給菌后24h腹腔注射相應劑量17-AAG,給菌后48h,給予小鼠10%水合氯醛200μL,打開其胸腔,從心尖處抽取200μL血液,倍比稀釋后,涂布于BHI固體培養(yǎng)基進行細菌計數(shù)。灌洗后無菌打開頭顱,取出腦組織,用組織勻漿器研磨,倍比稀釋后,計數(shù)細菌菌落數(shù)。取其肝臟和脾臟,加入1mLPBS研磨成勻漿,倍比梯度稀釋后,涂布于BHI固體培養(yǎng)基中,計數(shù)平板菌落數(shù)。48h內(nèi)死亡小鼠應立即解剖取其血液、腦、肝、脾。(2)協(xié)同作用取24只小鼠,隨機分為17-AAG組、氨芐青霉素組、17-AAG聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對照組,每組6只。每組小鼠腹腔注射李斯特菌100μl(5×106CFU/mL),分別在感染后2h、6h、24h給藥,各組分別腹腔注射17-AAG5μg/g、腹腔注射氨芐青霉素20μg/g、腹腔注射17-AAG 5μg/g后腹腔注射20μg/g氨芐青霉素、以及腹腔注射等量PBS。給菌48h后,解剖小鼠,取其心臟血、腦組織、肝臟、脾臟,涂布于BHI固體平板,計數(shù)細菌數(shù)。3、循環(huán)血腦微血管內(nèi)皮細胞(cBMECs)的計數(shù)(1)劑量依賴效應小鼠隨機分為0、2μg/g、5μg/g、10μg/g17-AAG四種劑量組,每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌,分別于給菌前2h和給菌后24h腹腔注射相應劑量17-AAG,給菌后48h解剖小鼠,取心臟血液,并裂解紅細胞。按照說明書準備好磁珠,并用Hanks平衡鹽溶液和5%FBS混合液(HBSS+5%FCS)重懸至終濃度為4×108個/mL。血液標本中的內(nèi)皮細胞被UEAI lectin包被的磁珠吸附后,被海藻糖洗脫,然后又重新吸附于MSFD2抗體包被的磁珠上。這些內(nèi)皮細胞表達CD146分子,提示其內(nèi)皮細胞來源,同時表達MSFD2分子,表明其來源自腦部。通過PE包被的CD146抗體標記吸附在MSFD2抗體包被磁珠上的細胞,轉(zhuǎn)移至細胞計數(shù)器上,熒光下計數(shù)血液標本中的cBMECs數(shù)量。(2)協(xié)同作用小鼠隨機分為17-AAG組、氨芐青霉素組、17-AAG聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對照組,每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌,分別在感染后2h、6h、24h給藥,各組分別腹腔注射17-AAG5μg/g、腹腔注射氨芐青霉素20p,g/g、腹腔注射17-AAG 5μg/g后腹腔注射20μg/g氨芐青霉素、以及腹腔注射等量PBS,給菌48h后,解剖取其心臟血,計數(shù)cBMECs。4、腦組織中依文思藍(EB)含量的測定(1)劑量依賴效應小鼠隨機分為不同17-AAG劑量組,給菌給藥,方法同2(1),于解剖前3h腹腔注射EB (50μg/g),存活3h后,麻醉,用30mL預冷PBS心臟灌注,打開頭顱,取出腦組織,放入含有1mL去離子甲酰胺的EP管內(nèi),50℃水浴48h,5200rpm離心10min,取上清液,620nm分光光度計測定吸光度,根據(jù)吸光度在繪制的標準曲線中查得EB的濃度。(2)協(xié)同作用小鼠隨機分為17-AAG組、氨芐青霉素組、17-AAG聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對照組,給菌給藥,方法同2(2),于解剖前3h腹腔注射EB,測定腦組織中EB含量。5、腦脊液(CSF)中NF-κB p65的測定(1)劑量依賴效應小鼠隨機分為不同17-AAG劑量組,給菌給藥,方法同2(1),給菌48h后,解剖小鼠,取出小鼠腦組織,用200μLPBS沖洗腦室和顱腔以收集腦脊液,10μLCSF中含有10個紅細胞的標本視為污染標本,然后用小鼠NF-κB p65 ELISA試劑盒測定腦脊液中p65的含量。(2)協(xié)同作用小鼠隨機分為17-AAG組、氨芐青霉素組、17-AAG聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對照組,給菌給藥方法同2(2),給菌48h后,取其CSF測定p65含量。6、IL-10的檢測小鼠隨機分為17-AAG組、氨芐青霉素組、17-AAG聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對照組,給菌用藥方法同2(2),給菌48h后,解剖小鼠,采集心臟血,于2-8℃5200rpm離心15分鐘,30分鐘內(nèi)收集好血清,用IL-10 ELISA試劑盒檢測IL-10含量。7、肝臟病理學分析采集PBS對照組和10μg/g17-AAG劑量組小鼠肝臟組織,于10%甲醛固定后,經(jīng)水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、貼片、烤片、HE染色、封片后,于顯微鏡下進行病理觀察。二、卡博替尼對李斯特菌小鼠體內(nèi)感染的阻斷作用1、生存曲線分析將小鼠隨機分為4組：卡博替尼組、氨芐青霉素組、卡博替尼聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對照組,每組9只,每只小鼠腹腔注射1×106CFU李斯特菌,并分別在感染后6h、12h、24h給藥,各組分別灌胃給予卡博替尼20gg/g、腹腔注射氨芐青霉素20μg/g、灌胃卡博替尼20μg/g后腹腔注射20μg/g氨芐青霉素、以及腹腔注射等量PBS,每天記錄觀察小鼠的臨床癥狀和生存情況,共5d。2、血液、腦組織細菌計數(shù)(1)劑量依賴效應將小鼠隨機分為0.10μg/g、20μg/g、30μg/g卡博替尼四種劑量組,每組5只。每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌,分別于給菌前2h和給菌后24h灌胃相應劑量卡博替尼。給菌后48h,給予小鼠10%水合氯醛200μL,打開其胸腔,從心尖處抽取200μL血液,倍比稀釋后,涂布于BHI固體培養(yǎng)基進行細菌計數(shù)。灌洗后無菌打開頭顱,取出腦組織,用組織勻漿器研磨,倍比稀釋后,計數(shù)細菌菌落數(shù)。(2)協(xié)同作用將小鼠隨機分為卡博替尼組、氨芐青霉素組、卡博替尼聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對照組,每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌,分別在感染后2、6、24h給藥,各組分別灌胃給予卡博替尼20gg/g、腹腔注射氨芐青霉素20μg/g、灌胃卡博替尼20μg/g后腹腔注射20μg/g氨芐青霉素、以及腹腔注射等量PBS,給菌后48h,無菌取其血液和腦組織,計數(shù)細菌菌落數(shù)。3、循環(huán)血腦微血管內(nèi)皮細胞的計數(shù)小鼠隨機分為卡博替尼組、氨芐青霉素組、卡博替尼聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對照組,給菌給藥方法同2(2),感染李斯特菌48h后,解剖取其心臟血,并裂解紅細胞。按照說明書準備好磁珠,并用Hanks平衡鹽溶液和5%FBS混合液(HBSS+5 %FCS)重懸至終濃度為4×108個/mL。血液標本中的內(nèi)皮細胞被UEAIlectin包被的磁珠吸附后,被海藻糖洗脫,然后又重新吸附于MSFD2抗體包被的磁珠上。這些內(nèi)皮細胞表達CD146分子,提示其內(nèi)皮細胞來源,同時表達MSFD2分子,表明其來源自腦部。通過PE包被的CD146抗體標記吸附在MSFD2抗體包被磁珠上的細胞,轉(zhuǎn)移至細胞計數(shù)器上,熒光下計數(shù)血液標本中的cBMECs數(shù)量。4、IL-10的檢測小鼠隨機分為卡博替尼組、氨芐青霉素組、卡博替尼聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對照組,給菌用藥方法同2(2),給菌48h后,采集心臟血,于2-8℃5200rpm離心15分鐘,30分鐘內(nèi)收集好血清,用IL-10ELISA試劑盒檢測IL-10含量。5、腦脊液中NF-κB p65的測定小鼠隨機分為卡博替尼組、氨芐青霉素組、卡博替尼聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對照組,給菌用藥方法同2(2),解剖小鼠,取出小鼠腦組織,用200μLPBS沖洗腦室和顱腔以收集腦脊液(CSF),10μLCSF中含有10個紅細胞的標本視為污染標本,然后用小鼠NF-κB p65 ELISA試劑盒測定腦脊液中p65的含量。6、腦組織中依文思藍含量的測定小鼠隨機分為卡博替尼組、氨芐青霉素組、卡博替尼聯(lián)合氨芐青霉素組、PBS對照組,給菌給藥方法同2(2),小鼠于解剖前3h腹腔注射EB (50μg/g),存活3h后,麻醉,用30mL預冷PBS心臟灌注,打開頭顱,取出腦組織,放入含有1mL去離子甲酰胺的EP管內(nèi),50℃水浴48h,5200rpm離心10min,取上清液,620nm分光光度計測定吸光度,根據(jù)吸光度在繪制的標準曲線中查得EB的濃度。7、腦組織病理學分析采集腦組織,于10%甲醛固定后,經(jīng)水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、貼片、烤片、HE染色、封片后,于顯微鏡下進行病理觀察。統(tǒng)計學分析本研究的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示,兩組的比較運用t檢驗,運用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學分析,以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義,檢驗水準為a=0.05。結(jié)果一、17-AAG對李斯特菌小鼠體內(nèi)感染的阻斷作用1.17-AAG組、氨芐青霉素組、17-AAG聯(lián)合氨芐青霉素組感染小鼠的生存率均明顯高于PBS對照組。2.17-AAG呈劑量依賴性抑制李斯特菌在小鼠血液、腦組織、肝臟、脾臟的增殖,并呈劑量依賴性減少血液cBMECs數(shù)量、腦組織中EB含量、腦脊液中NF-κB p65含量。3.17-AAG聯(lián)合氨芐青霉素組相比單獨用藥組,小鼠血液、腦組織、肝臟、脾臟的李斯特菌數(shù)量、cBMECs數(shù)量、腦組織中EB含量、腦脊液中NF-κB p65含量均顯著降低。4.17-AAG用藥組相比PBS對照組,小鼠肝臟組織病理變化減輕。二、卡博替尼對李斯特菌小鼠體內(nèi)感染的阻斷作用1.卡博替尼組、氨芐青霉素組、卡博替尼聯(lián)合氨芐青霉素組感染小鼠的生存率明顯高于PBS對照組。2.卡博替尼呈劑量依賴性降低感染小鼠血液、腦組織中李斯特菌數(shù)量。3.卡博替尼聯(lián)合氨芐青霉素用藥組相比于單獨用藥組,外周血cBMECs數(shù)量、腦組織中EB含量、腦脊液中NF-κB p65含量、血液IL-10含量均顯著降低。4.聯(lián)合用藥組和單獨用藥組腦組織炎癥變化均較PBS組減輕,其中聯(lián)合用藥組僅見少量的炎癥細胞。結(jié)論由上可見：c-Met受體酪氨酸激酶抑制劑17-AAG和卡博替尼能夠在一定程度上抑制李斯特菌在小鼠體內(nèi)增殖,阻斷李斯特菌菌血癥和腦膜炎的發(fā)生,并與氨芐青霉素可能具有一定程度上的協(xié)同作用。
【關鍵詞】：產(chǎn)單核細胞李斯特菌 17-AAG 卡博替尼 氨芐青霉素 血腦屏障
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-26
• 前言26-32
• 第一章 17-AAG阻斷小鼠體內(nèi)產(chǎn)單核細胞李斯特菌感染的實驗研究32-49
• 1.1 材料32-34
• 1.2 方法34-40
• 1.3 結(jié)果40-46
• 1.4 討論46-49
• 第二章 卡博替尼阻斷小鼠體內(nèi)產(chǎn)單核細胞李斯特菌感染的實驗研究49-64
• 2.1 材料49-51
• 2.2 方法51-55
• 2.3 結(jié)果55-61
• 2.4 討論61-64
• 全文總結(jié)64-67
• 參考文獻67-74
• 英文縮略詞表74-75
• 攻讀學位期間發(fā)表論文75-76
• 致謝76-77

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  本文關鍵詞：c-Met抑制劑17-AAG和卡博替尼對小鼠體內(nèi)產(chǎn)單核細胞李斯特菌感染的阻斷作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：467286