本文關(guān)鍵詞：纖毛運(yùn)送蛋白IFT25與IFT27基因分析及體內(nèi)外互作研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：纖毛內(nèi)運(yùn)送(IFT)是纖毛內(nèi)運(yùn)送顆粒在纖毛基部和其頂端之間進(jìn)行的雙向運(yùn)動(dòng)。IFT顆粒由復(fù)合物A和B組成,分別至少含有8個(gè)和12個(gè)IFT蛋白分子。最新研究表明,纖毛是一種細(xì)胞天線,負(fù)責(zé)胞外信息向胞內(nèi)的傳遞,而IFT顆粒是纖毛生物生成和纖毛信號(hào)分子在纖毛和胞內(nèi)進(jìn)行傳遞所必需的。目前已知纖毛物理缺失或其功能缺陷會(huì)導(dǎo)致糖尿病和肥胖等多種營養(yǎng)代謝疾病的發(fā)生,這一類病因此又被統(tǒng)稱為“纖毛病”。然而,目前的現(xiàn)狀是人們對(duì)調(diào)控纖毛內(nèi)運(yùn)送的分子機(jī)制知之甚少。IFT25和IFT27是IFT-B復(fù)合物的小磷酸化蛋白和小G蛋白組分,由ift25和ift27編碼。本研究通過對(duì)萊茵衣藻中IFT25及IFT27氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,我們得知二者在不同物種中高度保守。纖毛運(yùn)送蛋白IFT25為親水性蛋白,IFT27為疏水性蛋白,二者皆無跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽,屬于非分泌型胞內(nèi)蛋白。在體外相互作用的研究中,以pGEX-2T, pMAL-C2H為表達(dá)載體,將目的基因ift25和ift27分別與上述兩種載體相連構(gòu)成重組質(zhì)粒,然后導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過Western blotting檢測(cè)得到IFT25與IFT27在體外表達(dá)的關(guān)系。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,IFT25單獨(dú)表達(dá)時(shí)為可溶性蛋白,IFT27單獨(dú)表達(dá)時(shí)為水不溶性蛋白,而IFT25與IFT27共表達(dá)成的融合蛋白為水溶性蛋白。在體內(nèi)相互作用研究中,采用基因沉默的方法,分別使IFT25或IFT27在細(xì)胞纖毛內(nèi)的表達(dá)量降低,以FLA10為內(nèi)參,Western blotting法檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量,探究其中一個(gè)表達(dá)量降低時(shí),對(duì)另一蛋白表達(dá)量的影響。RNA水平分析發(fā)現(xiàn),以野生型CC-125的表達(dá)量為對(duì)照,ift25基因沉默后,ift25基因的表達(dá)量降低而ift27表達(dá)量卻增高；然而ift27基因沉默后,ift27表達(dá)量降低而ift25不變。蛋白水平分析發(fā)現(xiàn),IFT25蛋白水平降低時(shí)IFT27蛋白含量也隨之下降,而當(dāng)IFT27蛋白水平降低時(shí)IFT25含量不變。由之前的報(bào)道可知IFT27的缺陷會(huì)引起纖毛病,而本研究告訴我們IFT25與IFT27無論在體內(nèi)還是體外都存在相互作用,因此我們推測(cè)IFT25與IFT27協(xié)同作用于纖毛的裝配,并深刻影響其生理功能。
【關(guān)鍵詞】：萊茵衣藻 纖毛 IFT25 IFT27 基因分析 體內(nèi)外互作
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 前言8-20
• 1.1 萊茵衣藻8-10
• 1.1.1. 萊茵衣藻的結(jié)構(gòu)8
• 1.1.2 萊茵衣藻生活史8-9
• 1.1.3 萊茵衣藻作為實(shí)驗(yàn)載體的優(yōu)勢(shì)9-10
• 1.2 纖毛10-12
• 1.2.1 纖毛的結(jié)構(gòu)10
• 1.2.2 纖毛的分類10-11
• 1.2.3 纖毛的功能11-12
• 1.2.4 纖毛病12
• 1.3 纖毛運(yùn)送蛋白(IFT)12-15
• 1.3.1 IFT的發(fā)現(xiàn)12
• 1.3.2 IFT的組成12-13
• 1.3.3 IFT的運(yùn)動(dòng)機(jī)制13-15
• 1.4 RNA干擾15-17
• 1.4.1 RNA干擾載體構(gòu)建的方法16
• 1.4.2 RNA干擾載體構(gòu)建的特征16-17
• 1.5 萊茵衣藻核轉(zhuǎn)化17-18
• 1.5.1 基因槍法17
• 1.5.2 玻璃珠法17
• 1.5.3 電擊法17-18
• 1.6 本實(shí)驗(yàn)的研究意義及研究?jī)?nèi)容18-20
• 1.6.1 研究的背景和意義18-19
• 1.6.2 主要內(nèi)容19-20
• 2 材料與方法20-42
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-28
• 2.1.1 藻種,菌種,質(zhì)粒及引物20-21
• 2.1.2 主要藥品21-23
• 2.1.3 儀器與設(shè)備23-24
• 2.1.4 培養(yǎng)基24-25
• 2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制25-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-42
• 2.2.1 生物信息學(xué)在線分析及軟件應(yīng)用28-29
• 2.2.2 體外相互作用29-36
• 2.2.3 體內(nèi)相互作用36-42
• 3 結(jié)果與討論42-61
• 3.1 萊茵衣藻基因ift25與ift27生物信息學(xué)分析42-49
• 3.1.1 蛋白序列同源性分析42-43
• 3.1.2 蛋白理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析43-49
• 3.2 IFT25與IFT27體外相互作用研究49-55
• 3.2.1 大腸桿菌表達(dá)載體pGEX-2T-IFT25,pMAL-C2H-IFT27的構(gòu)建49-50
• 3.2.2 重組質(zhì)粒pGEX2T-IFT25,pMAL-C2H-IFT27的雙切驗(yàn)證50-51
• 3.2.3 轉(zhuǎn)化菌株載體導(dǎo)入驗(yàn)證51
• 3.2.4 IFT25和IFT27在蛋白水平的相互作用51-55
• 3.3 IFT25與IFT27體內(nèi)相互作用研究55-61
• 3.3.1 萊茵衣藻人工干擾載體的構(gòu)建(以pChlamyRNA3int-IFT25為例)55
• 3.3.2 pChlamyRNA3int-IF25及pChlamyRNA3int-IFT27的測(cè)序驗(yàn)證55-56
• 3.3.3 萊茵衣藻生長(zhǎng)曲線測(cè)定56-57
• 3.3.4 萊茵衣藻核轉(zhuǎn)化57
• 3.3.5 抗性藻種的篩選57-58
• 3.3.6 IFT25與IFT27在轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)系58-59
• 3.3.7 IFT25與IFT27在蛋白水平的關(guān)系59-61
• 4 結(jié)論61-62
• 4.1 萊茵衣藻IFT25與IFT27蛋白序列分析61
• 4.2 體外相互作用61
• 4.3 體內(nèi)相互作用61-62
• 5 展望62-63
• 6 參考文獻(xiàn)63-68
• 7 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況68-69
• 8 致謝69-70
• 附錄70

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本文編號(hào)：465478