發(fā)布時間：2017-06-20 11:18

  本文關鍵詞：纖毛運送蛋白IFT25與IFT27基因分析及體內外互作研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：纖毛內運送(IFT)是纖毛內運送顆粒在纖毛基部和其頂端之間進行的雙向運動。IFT顆粒由復合物A和B組成,分別至少含有8個和12個IFT蛋白分子。最新研究表明,纖毛是一種細胞天線,負責胞外信息向胞內的傳遞,而IFT顆粒是纖毛生物生成和纖毛信號分子在纖毛和胞內進行傳遞所必需的。目前已知纖毛物理缺失或其功能缺陷會導致糖尿病和肥胖等多種營養(yǎng)代謝疾病的發(fā)生,這一類病因此又被統(tǒng)稱為“纖毛病”。然而,目前的現(xiàn)狀是人們對調控纖毛內運送的分子機制知之甚少。IFT25和IFT27是IFT-B復合物的小磷酸化蛋白和小G蛋白組分,由ift25和ift27編碼。本研究通過對萊茵衣藻中IFT25及IFT27氨基酸序列進行生物信息學分析,我們得知二者在不同物種中高度保守。纖毛運送蛋白IFT25為親水性蛋白,IFT27為疏水性蛋白,二者皆無跨膜結構和信號肽,屬于非分泌型胞內蛋白。在體外相互作用的研究中,以pGEX-2T, pMAL-C2H為表達載體,將目的基因ift25和ift27分別與上述兩種載體相連構成重組質粒,然后導入大腸桿菌BL21 (DE3)中進行誘導表達。通過Western blotting檢測得到IFT25與IFT27在體外表達的關系。由實驗結果可知,IFT25單獨表達時為可溶性蛋白,IFT27單獨表達時為水不溶性蛋白,而IFT25與IFT27共表達成的融合蛋白為水溶性蛋白。在體內相互作用研究中,采用基因沉默的方法,分別使IFT25或IFT27在細胞纖毛內的表達量降低,以FLA10為內參,Western blotting法檢測目標蛋白的表達量,探究其中一個表達量降低時,對另一蛋白表達量的影響。RNA水平分析發(fā)現(xiàn),以野生型CC-125的表達量為對照,ift25基因沉默后,ift25基因的表達量降低而ift27表達量卻增高；然而ift27基因沉默后,ift27表達量降低而ift25不變。蛋白水平分析發(fā)現(xiàn),IFT25蛋白水平降低時IFT27蛋白含量也隨之下降,而當IFT27蛋白水平降低時IFT25含量不變。由之前的報道可知IFT27的缺陷會引起纖毛病,而本研究告訴我們IFT25與IFT27無論在體內還是體外都存在相互作用,因此我們推測IFT25與IFT27協(xié)同作用于纖毛的裝配,并深刻影響其生理功能。
【關鍵詞】：萊茵衣藻 纖毛 IFT25 IFT27 基因分析 體內外互作
【學位授予單位】：天津科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 前言8-20
• 1.1 萊茵衣藻8-10
• 1.1.1. 萊茵衣藻的結構8
• 1.1.2 萊茵衣藻生活史8-9
• 1.1.3 萊茵衣藻作為實驗載體的優(yōu)勢9-10
• 1.2 纖毛10-12
• 1.2.1 纖毛的結構10
• 1.2.2 纖毛的分類10-11
• 1.2.3 纖毛的功能11-12
• 1.2.4 纖毛病12
• 1.3 纖毛運送蛋白(IFT)12-15
• 1.3.1 IFT的發(fā)現(xiàn)12
• 1.3.2 IFT的組成12-13
• 1.3.3 IFT的運動機制13-15
• 1.4 RNA干擾15-17
• 1.4.1 RNA干擾載體構建的方法16
• 1.4.2 RNA干擾載體構建的特征16-17
• 1.5 萊茵衣藻核轉化17-18
• 1.5.1 基因槍法17
• 1.5.2 玻璃珠法17
• 1.5.3 電擊法17-18
• 1.6 本實驗的研究意義及研究內容18-20
• 1.6.1 研究的背景和意義18-19
• 1.6.2 主要內容19-20
• 2 材料與方法20-42
• 2.1 實驗材料20-28
• 2.1.1 藻種,菌種,質粒及引物20-21
• 2.1.2 主要藥品21-23
• 2.1.3 儀器與設備23-24
• 2.1.4 培養(yǎng)基24-25
• 2.1.5 標準溶液的配制25-28
• 2.2 實驗方法28-42
• 2.2.1 生物信息學在線分析及軟件應用28-29
• 2.2.2 體外相互作用29-36
• 2.2.3 體內相互作用36-42
• 3 結果與討論42-61
• 3.1 萊茵衣藻基因ift25與ift27生物信息學分析42-49
• 3.1.1 蛋白序列同源性分析42-43
• 3.1.2 蛋白理化性質與結構分析43-49
• 3.2 IFT25與IFT27體外相互作用研究49-55
• 3.2.1 大腸桿菌表達載體pGEX-2T-IFT25,pMAL-C2H-IFT27的構建49-50
• 3.2.2 重組質粒pGEX2T-IFT25,pMAL-C2H-IFT27的雙切驗證50-51
• 3.2.3 轉化菌株載體導入驗證51
• 3.2.4 IFT25和IFT27在蛋白水平的相互作用51-55
• 3.3 IFT25與IFT27體內相互作用研究55-61
• 3.3.1 萊茵衣藻人工干擾載體的構建(以pChlamyRNA3int-IFT25為例)55
• 3.3.2 pChlamyRNA3int-IF25及pChlamyRNA3int-IFT27的測序驗證55-56
• 3.3.3 萊茵衣藻生長曲線測定56-57
• 3.3.4 萊茵衣藻核轉化57
• 3.3.5 抗性藻種的篩選57-58
• 3.3.6 IFT25與IFT27在轉錄水平的關系58-59
• 3.3.7 IFT25與IFT27在蛋白水平的關系59-61
• 4 結論61-62
• 4.1 萊茵衣藻IFT25與IFT27蛋白序列分析61
• 4.2 體外相互作用61
• 4.3 體內相互作用61-62
• 5 展望62-63
• 6 參考文獻63-68
• 7 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文情況68-69
• 8 致謝69-70
• 附錄70

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本文編號：465478