本文關(guān)鍵詞：Notch信號通路在BMP2誘導(dǎo)iMEF細(xì)胞成骨分化中的作用及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨形態(tài)形成蛋白2(bone morphogenetic proteins 2,BMP2)具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨能力,且已應(yīng)用于臨床骨科疾病的治療,但臨床應(yīng)用效果不如早期實(shí)驗(yàn)室研究,因此有必要對其成骨機(jī)制做進(jìn)一步深入的研究。目前許多研究表明Notch信號在成骨分化中發(fā)揮著必不可缺少的作用。那么Notch信號能促進(jìn)BMP2成骨嗎?其可能機(jī)制如何?本研究擬在確定Notch信號對BMP2介導(dǎo)MSCs成骨中的作用及闡明其可能的機(jī)制,以期在改進(jìn)BMP2臨床治療效果上提供潛在的解決方案。第一部分:目的:了解Notch信號通路在BMP2誘導(dǎo)的永生化小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(immortalized mouse embryonic fibroblasts,iMEF)成骨分化中的作用。方法:利用γ-內(nèi)分泌酶抑制劑(DAPT)、顯性負(fù)性突變型Notch1腺病毒(Ad-dn Notch1)和過表達(dá)DLL1腺病毒(Ad-DLL1),分別下調(diào)和上調(diào)Notch信號,采用細(xì)胞化學(xué)染色及活性測定檢測成骨早期指標(biāo)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和晚期成骨指標(biāo)鈣鹽沉積,通過qRT-PCR檢測成骨基因的水平。結(jié)果:明顯抑制了BMP2介導(dǎo)的早期成骨指標(biāo)ALP的活性及晚期成骨指標(biāo)鈣鹽的沉積,且呈劑量依賴性(與對照組相比);與BMP+RFP組相比,dnNotch1能夠抑制BMP2介導(dǎo)的成骨早期指標(biāo)ALP的活性,抑制晚期成骨指標(biāo)鈣鹽的沉積及成骨相關(guān)基因的表達(dá)。而dll1顯著促進(jìn)bmp2誘導(dǎo)imef細(xì)胞早期成骨指標(biāo)alp的活性,晚期成骨指標(biāo)鈣鹽的沉積及成骨相關(guān)基因的表達(dá)(p0.05)。結(jié)論:notch有重要的促進(jìn)bmp2誘導(dǎo)間充質(zhì)干成骨分化的作用。第二部分:目的:探討notch促進(jìn)bmp2誘導(dǎo)的imef細(xì)胞成骨分化中的分子機(jī)制。方法:利用γ-內(nèi)分泌酶抑制劑(dapt)、顯性負(fù)性突變型notch1腺病毒(ad-dnnotch1)和過表達(dá)dll1腺病毒(ad-dll1),分別下調(diào)和上調(diào)notch信號,首先采用q-pcr檢測了dapt、dll1、dnnotch1對bmp2信號通路Ⅰ、Ⅱ型受體mrna表達(dá)水平的影響,其次采用westernblot和熒光素酶檢測其對經(jīng)典bmp2信號通路中smad1/5/8磷酸化水平和smad結(jié)合元件(smad-bindingelement,sbe)轉(zhuǎn)錄活性影響。最后,結(jié)晶紫染色測定細(xì)胞增殖的變化,流式細(xì)胞術(shù)分析周期及凋亡的影響。結(jié)果:與對照組相比,dapt作用下alk1、alk6、actrⅡ和actrⅡβmrna的表達(dá)沒有變化,而alk2、alk3、bmprⅡmrna的表達(dá)有不同程度下降,且alk2的下降與dapt成劑量依賴性;而dnnotch1作用下只有alk2的表達(dá)下調(diào),其他受體的表達(dá)沒有明顯變化;在dll1作用下,bmp2信號通路中Ⅰ、Ⅱ型受體alk2、alk3、bmprⅡ均表達(dá)上調(diào)。其次,免疫印跡(westernblot)和熒光素酶(sbe)實(shí)驗(yàn)顯示,dnnotch1明顯下調(diào)p-smad1/5/8水平及sbe轉(zhuǎn)錄活性,而對smad1/5/8總蛋白量沒有明顯改變;而dll1明顯上調(diào)smad1/5/8的磷酸化水平及sbe的轉(zhuǎn)錄活性,對總smad1/5/8蛋白量沒有明顯改變。結(jié)晶紫染色和流式細(xì)胞術(shù)(fcm)分析結(jié)果顯示,dnNotch1抑制BMP2介導(dǎo)的細(xì)胞增殖作用,使G2+S期的細(xì)胞數(shù)明顯減少(與對照組比);而DLL1則能顯著增加細(xì)胞的增殖作用,導(dǎo)致G2+S期的細(xì)胞數(shù)比對照組顯著增多;而細(xì)胞凋亡沒有變化(p0.05)。結(jié)論:Notch信號顯著促進(jìn)BM2介導(dǎo)的成骨分化,可能是通過影響B(tài)MP2相應(yīng)受體的表達(dá)、經(jīng)典BMP-Smad信號通路的激活及細(xì)胞的早期增殖來實(shí)現(xiàn)其促成骨作用的。
【關(guān)鍵詞】：Notch信號通路 BMP2 MSCs 成骨分化
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 技術(shù)路線12-13
• 前言13-17
• 參考文獻(xiàn)14-17
• 第一部分 Notch信號通路在BMP2誘導(dǎo)的iMEF細(xì)胞成骨分化中的作用研究17-34
• 1 材料與方法17-23
• 2 結(jié)果23-29
• 3 討論29-32
• 參考文獻(xiàn)32-34
• 第二部分 Notch信號通路促進(jìn)BMP2誘導(dǎo)iMEF細(xì)胞成骨作用機(jī)制研究34-48
• 1 材料與方法34-39
• 2 結(jié)果39-45
• 3 討論45-47
• 參考文獻(xiàn)47-48
• 全文總結(jié)48-49
• 文獻(xiàn)綜述49-59
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 致謝59-60
• 碩士在讀期間發(fā)表論文題錄60

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本文編號：463590