本文關(guān)鍵詞：PGE2對(duì)NR8383巨噬細(xì)胞株促進(jìn)HUVEC細(xì)胞遷移和成管能力調(diào)控作用的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景胚胎著床是成功妊娠的起始和重要環(huán)節(jié),人類(lèi)胚胎著床通常發(fā)生在排卵后的6-8天,這一時(shí)期稱(chēng)為圍著床期或著床窗,此乃妊娠發(fā)生與啟動(dòng)最重要的限速步驟。決定胚胎成功著床的因素眾多,其中良好的子宮內(nèi)膜容受性是一個(gè)關(guān)鍵因素。研究表明子宮內(nèi)膜發(fā)育過(guò)程分為三個(gè)階段：容受前期、容受期以及非容受期,只有在容受期,子宮內(nèi)膜才允許胚胎著床。子宮內(nèi)膜容受性的異常是造成胚胎著床失敗的重要因素。影響子宮內(nèi)膜容受性的因素非常多,至今還未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn),圍著床期生殖系統(tǒng)發(fā)生的生理性血管新生過(guò)程在子宮內(nèi)膜容受性建立過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。血管生成(angiogenesis)是指新生毛細(xì)血管從已經(jīng)存在的血管中發(fā)生和發(fā)育的整個(gè)過(guò)程,是組織再生的重要特征和必要前提,其具體步驟包括：血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移至原始血管基層裂解后形成的區(qū)域、增殖形成毛細(xì)血管芽、生長(zhǎng)及重建形成新動(dòng)脈或靜脈。成年個(gè)體的血管生成多發(fā)生在病理?xiàng)l件下,如炎癥和免疫反應(yīng),腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移以及損傷修復(fù)的過(guò)程中。特別值得一提的是,人類(lèi)生理性的血管生成僅存在于育齡期正常女性生殖系統(tǒng),其貫穿于整個(gè)卵巢周期和子宮內(nèi)膜周期的始終,表現(xiàn)為卵巢黃體血管網(wǎng)的形成和子宮內(nèi)膜血管生成微環(huán)境的建立,對(duì)于女性生殖系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育和內(nèi)分泌、生殖功能的維持至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜局部血管生成處于高峰狀態(tài)是圍著床期子宮內(nèi)膜顯著性的標(biāo)志之一,當(dāng)圍著床期子宮內(nèi)膜血管生成發(fā)生障礙,胚胎著床率會(huì)發(fā)生明顯降低,而胎兒流產(chǎn)率則出現(xiàn)明顯升高,提示子宮內(nèi)膜血管生成在胚胎著床與妊娠維持中均發(fā)揮著重要作用；排卵后形成的黃體是孕酮(Progesterone,P4)最主要的來(lái)源,其組織學(xué)的一個(gè)最顯著特征是形成一個(gè)富含血管的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),其血流速度在各腺體中居于首位,其分泌的P4的主要作用為促進(jìn)子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化、增強(qiáng)子宮內(nèi)膜容受性,利于胚胎著床和妊娠早期維持。排卵后黃體血管網(wǎng)的形成與孕酮的合成分泌密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)黃體血管網(wǎng)形成異常后,血清孕酮水平發(fā)生顯著降低,胚胎著床發(fā)生失敗。因此,圍著床期生殖系統(tǒng)的血管新生在胚胎成功著床與妊娠維持過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,但是調(diào)控圍著床期女性生殖系統(tǒng)血管新生的機(jī)制還未完全探明,值得進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn),女性生殖系統(tǒng)局部的巨噬細(xì)胞在維持正常女性生殖活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。圍著床期,子宮內(nèi)膜局部的巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著升高,并且會(huì)在著床點(diǎn)附近募集,提示其與胚胎著床可能存在相關(guān)性。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),圍著床期子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞分布與新生血管分布密切相關(guān),表明子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞可能在圍著床期子宮內(nèi)膜血管新生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。圍排卵期的卵巢中也存在局部巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加的現(xiàn)象,并且其在黃體周?chē)@著募集。國(guó)外有學(xué)者采用轉(zhuǎn)基因小鼠,在特定條件下敲除小鼠圍排卵期卵巢中的巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎著床完全失敗。該學(xué)者進(jìn)一步采用免疫組化實(shí)驗(yàn)方法觀察到,當(dāng)敲除卵巢巨噬細(xì)胞后,小鼠黃體血管網(wǎng)的形成發(fā)生顯著異常,血管結(jié)構(gòu)不完整,而且其血清中孕酮的水平也顯著降低。研究結(jié)果提示圍排卵期卵巢局部的巨噬細(xì)胞與排卵后黃體的形成密切相關(guān),并且巨噬細(xì)胞通過(guò)參與了排卵后黃體血管網(wǎng)的生成,在胚胎成功著床中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。大量研究表明,巨噬細(xì)胞可以合成和分泌多種促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子,其中最重要的一種細(xì)胞因子是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)。VEGF是體內(nèi)促進(jìn)血管生成的最重要的細(xì)胞因子之一,其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移還有損傷組織修復(fù)等病理生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。巨噬細(xì)胞是體內(nèi)VEGF的重要來(lái)源之一,巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌VEGF等促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子,參與組織血管的新生。眾多研究提示,圍著床期女性生殖系統(tǒng)局部的巨噬細(xì)胞通過(guò)參與血管新生的生理過(guò)程,從而在胚胎著床過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,但是生殖系統(tǒng)局部調(diào)控巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管新生的機(jī)制卻仍未完全闡明。圍著床期女性生殖系統(tǒng)局部微環(huán)境發(fā)生著明顯的變化,包括雌激素,孕激素在內(nèi)多種因子均顯著升高。其中,我們發(fā)現(xiàn),前列腺素E2(Prostaglandins E2,PGE2)可能是參與調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)局部巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管新生的重要因子之一。PGE2在女性正常生殖活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用,并且圍著床期其在子宮內(nèi)膜以及卵巢中的含量均顯著升高。并且巨噬細(xì)胞表面表達(dá)有PGE2特異性的受體,這些均提示圍著床期生殖系統(tǒng)中顯著升高的PGE2可能會(huì)與生殖系統(tǒng)局部的巨噬細(xì)胞之間發(fā)生交互作用,從而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞在女性生殖系統(tǒng)中促進(jìn)血管新生的作用。然而相關(guān)機(jī)制研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,分別采用不同濃度水平的PGE2處理大鼠NR8383巨噬細(xì)胞株,采用熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)方法,觀察不同濃度PGE2處理下大鼠NR8383巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF的信使RNA(mRNA)表達(dá)水平是否發(fā)生改變,揭示PGE2可以影響巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá)水平,從而影響巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管生成的能力。然后我們采用Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Matrigel基質(zhì)膠細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn),來(lái)分別觀察不同濃度PGE2的處理下,大鼠NR8383巨噬細(xì)胞株促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs遷徙和成管的能力是否發(fā)生變化,探討PGE2是否可以影響巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管生成的能力。最后,我們利用PGE2受體特異性抑制劑AH6809(PGE2 EP2受體特異性拮抗劑劑)和AH23848(PGE2 EP4受體特異性拮抗劑)來(lái)處理大鼠NR8383巨噬細(xì)胞株,分別采用熒光定量PCR技術(shù)以及Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Matrigel基質(zhì)膠細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn),來(lái)觀察PGE2受體特異性拮抗劑劑是否可以阻礙PGE2對(duì)巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管生成的調(diào)控作用。以上研究對(duì)進(jìn)一步明確圍著床期女性生殖系統(tǒng)局部微環(huán)境對(duì)巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管新生的相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究十分重要,并且為將來(lái)進(jìn)一步闡明PGE2對(duì)圍著床期女性生殖系統(tǒng)局部巨噬細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)的分子信號(hào)機(jī)制提供了理論依據(jù)。第一章PGE2影響NR8383巨噬細(xì)胞株VEGF mRNA的表達(dá)目的為了探討在圍著床期女性生殖系統(tǒng)發(fā)揮正常功能中起到關(guān)鍵作用的PGE2是否是調(diào)控女性生殖系統(tǒng)局部巨噬細(xì)胞的信號(hào)分子,我們選取大鼠巨噬細(xì)胞株NR8383進(jìn)行體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),通過(guò)采用0、0.1 nmol/L PGE2、1 nmol/L PGE2分別處理大鼠NR8383巨噬細(xì)胞株,通過(guò)檢測(cè)大鼠NR8383巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá)水平,來(lái)驗(yàn)證PGE2可以影響NR8383巨噬細(xì)胞合成分泌VEGF的能力。方法取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠NR8383巨噬細(xì)胞株,分別采用0 nmol/L PGE2,0.1nmol/L PGE2,1 nmol/L PGE2處理5天。將處理后的大鼠NR8383巨噬細(xì)胞放置在在37℃,5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5天后,分別收集不同PGE2水平處理下的大鼠NR8383巨噬細(xì)胞,在1000r/min離心5分鐘,去除上清液,然后用PBS漂洗后,再次1000r/min離心5分鐘,加入Trizol,并將大鼠NR8383巨噬細(xì)胞重懸,接下來(lái)分別提取大鼠NR8383巨噬細(xì)胞的RNA。采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)大鼠NR8383巨噬細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)水平。所有的數(shù)據(jù)資料均采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1.PGE2可以促進(jìn)大鼠NR8383巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá)與未采用PGE2處理的NR8383大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá)水平相比,經(jīng)PGE2處理后的NR8383細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá)水平明顯升高(P0.000)。2.PGE2促進(jìn)大鼠NR8383巨噬細(xì)胞表達(dá)VEGF mRNA的能力隨著PGE2的濃度升高而升高。qPCR的結(jié)果顯示,與未加PGE2處理的對(duì)照組NR8383大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)水平相比,0.1nmol/L PGE2處理后的NR8383細(xì)胞內(nèi)VEGFmRNA的表達(dá)水平顯著升高(P0.05)；與0.1nmol/L PGE2處理組相比,1nmol/LPGE2處理后的NR8383細(xì)胞內(nèi)VEGF的mRNA表達(dá)水平有升高趨勢(shì),但是兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PGE2處理后的大鼠NR8383巨噬細(xì)胞其細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá)顯著升高。并且,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),PGE2對(duì)大鼠NR8383巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用與PGE2的作用濃度成正比,隨著PGE2處理濃度的升高,大鼠NR8383巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá)水平也隨之升高。因此,實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PGE2可以增強(qiáng)大鼠NR8383巨噬細(xì)胞合成分泌VEGF,從而增強(qiáng)其促進(jìn)血管生成的能力。第二章PGE2影響NR8383細(xì)胞株促進(jìn)HUVEC細(xì)胞遷移的能力目的如前所示,PGE2可以增加大鼠NR8383巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá),提示PGE2可能是通過(guò)促進(jìn)大鼠NR8383巨噬細(xì)胞合成分泌VEGF,從而增強(qiáng)大鼠NR8383巨噬細(xì)胞對(duì)血管生成的促進(jìn)作用。因此,我們采用體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)-Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn),取不同濃度PGE2處理下的NR8383大鼠巨噬細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液來(lái)處理HUVECs,觀察HUVECs遷移的數(shù)目,驗(yàn)證PGE2是否可以增強(qiáng)大鼠NR8383巨噬細(xì)胞促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的能力,進(jìn)一步論證PGE2可以增強(qiáng)大鼠NR.8383巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管生成的作用。方法選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠NR8383巨噬細(xì)胞,以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1 X105／mL,分別用0、0.1nmol/LPGE2、1nmol/L PGE2去處理大鼠NR8383巨噬細(xì)胞,處理5天。5天后,采用2000 r/min離心5 mmin,去除細(xì)胞碎片,取細(xì)胞培養(yǎng)上清液用于實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs,以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1 X106／mL,在Transwell小室細(xì)胞培養(yǎng)板的上室加入100μLHUVECs懸液；將不同PGE2濃度處理后的大鼠NR8383巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液放入Transwell小室細(xì)胞培養(yǎng)板的下室,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。12h后,將Transwell小室取出,用棉棒輕輕擦去小室膜上表面的細(xì)胞；10%甲醛固定30min；用PBS洗2次,每次5 min；結(jié)晶紫染色30 min,清水反復(fù)沖洗,晾干；取下聚碳酸酯膜,中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下(×200)計(jì)數(shù)遷移到膜下表面的細(xì)胞,每張膜隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野,取平均數(shù)作為趨化細(xì)胞數(shù)。多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果1.PGE2處理后增強(qiáng)大鼠NR8383巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs遷移的能力。Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,發(fā)生跨膜遷移的HUVECs細(xì)胞數(shù)量在無(wú)PGE2處理組、0.1nmol/L PGE2處理組、lnmol/L PGE2處理組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=723.182,P0.001)。與未采用PGE2處理的對(duì)照組相比,0.1nmol/L PGE2處理組和lnmol/L PGE2處理組,跨膜遷移的HUVECs細(xì)胞數(shù)發(fā)生顯著升高(P0.000)。提示PGE2處理可以顯著增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs趨化遷移的能力。2.PGE2增強(qiáng)大鼠NR8383巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVEC遷移的能力與PGE2作用濃度呈正相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn),與未采用PGE2處理的對(duì)照組相比,0.1nmol/L PGE2處理組遷移到膜下的HUVECs細(xì)胞數(shù)顯著升高(P0.000)；與O.lnmol/L PGE2處理組相比,lnmol/L PGE2處理組遷移跨膜的HUVECs細(xì)胞數(shù)顯著升高(P0.05),提示PGE2增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs遷移趨化的能力與PGE2的處理濃度呈正相關(guān)。結(jié)論Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)PGE2處理過(guò)后的大鼠NR8383巨噬細(xì)胞其促進(jìn)HUVECs遷移的能力明顯增強(qiáng),并且其促進(jìn)HUVECs遷移的能力隨著PGE2處理濃度的升高而升高。研究結(jié)果提示,PGE2可以增強(qiáng)大鼠NR8383巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化募集的能力,而新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的募集趨化是血管生成過(guò)程中的重要步驟,因此進(jìn)一步提示,PGE2可以增強(qiáng)大鼠NR8383巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管生成的能力。第三章PGE2影響NR8383細(xì)胞株促進(jìn)HUVEC細(xì)胞成管的能力目的上述研究發(fā)現(xiàn),PGE2可以增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs遷移的能力,提示PGE2可能是通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的趨化募集來(lái)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞促血管生成的作用。但是血管新生是個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程,其中新生血管內(nèi)皮細(xì)胞形成血管樣的結(jié)構(gòu)是血管新生過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。因此我們進(jìn)一步采用Matrigel基質(zhì)膠細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn),通過(guò)不同PGE2濃度處理NR8383大鼠巨噬細(xì)胞,取不同處理下的細(xì)胞培養(yǎng)上清液來(lái)處理HUVECs,觀察HUVECs成管的面積。從而進(jìn)一步驗(yàn)證PGE2對(duì)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管生成的調(diào)控作用。方法在實(shí)驗(yàn)前預(yù)先將Tip頭、培養(yǎng)板等所有實(shí)驗(yàn)中會(huì)接觸Matrigel基質(zhì)膠的物品放置在-20℃冰箱進(jìn)行預(yù)冷。然后,把Matrigel基質(zhì)膠置于2—-8℃冰箱中過(guò)夜融化。當(dāng)基質(zhì)膠呈現(xiàn)液態(tài)狀后,向96孔培養(yǎng)板中每孔加入60μL,置于37℃ 1 h以成膠。用上述方法獲取的不同處理作用后NR3838細(xì)胞培養(yǎng)上清液重懸HUVECs,接種入已鋪膠的96孔板中,每孔1.5～2×104個(gè)細(xì)胞,每組設(shè)3復(fù)孔。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板,在倒置顯微鏡下(X4)觀察并拍照,采用Image-Pro Plus軟件分析形成小管的面積。多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果：1.PGE2可以增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs成管的能力。Matrigel基質(zhì)膠細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HUVECs細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)的面積在無(wú)PGE2處理組、0.1nmol/L PGE2處理組、lnmol/L PGE2處理組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=93.655,P0.001)。研究發(fā)現(xiàn),與未采用PGE2處理的對(duì)照組相比,0.1nmol/L PGE2處理組與lnmol/L PGE2處理組的HUVECs細(xì)胞形成的管狀結(jié)構(gòu)面積都顯著增大(P0.000)。提示PGE2處理可以顯著增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs形成管狀結(jié)構(gòu)的能力。2.PGE2增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs成管的能力隨著PGE2處理濃度的提高而提高。研究發(fā)現(xiàn),與未采用PGE2處理的對(duì)照組相比,0.1nmol/L PGE2處理組HUVECs細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)的面積顯著升高(P0.000)；與0.1nmol/L PGE2處理組相比,1nmol/L PGE2處理組HUVECs形成管狀結(jié)構(gòu)的面積也發(fā)生顯著升高(P0.05),提示PGE2增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs形成管狀結(jié)構(gòu)的能力與PGE2處理的濃度呈正相關(guān)。結(jié)論：Matrigel基質(zhì)膠細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,PGE2處理后的NR8383大鼠巨噬細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液可以顯著促進(jìn)HUVECs成管,其成管面積顯著增加；并且PGE2增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs成管的能力隨著PGE2處理濃度的升高而升高。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),PGE2可能通過(guò)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)這個(gè)過(guò)程,來(lái)增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管生成的能力。提示PGE2是巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管新生過(guò)程中的一個(gè)重要調(diào)控因子。值得我們進(jìn)一步探索其具體的分子信號(hào)機(jī)制。第四章PGE2特異性受體拮抗劑抑制PGE2對(duì)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVEC細(xì)胞促進(jìn)血管生成的調(diào)控作用目的上述相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PGE2可以作用于NR8383大鼠巨噬細(xì)胞,提高NR8383大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá)水平,并且顯著增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs遷移和成管的能力,增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管生成的能力。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PGE2與NR8383大鼠巨噬細(xì)胞之間的相互作用是增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管生成的直接原因,我們選擇了PGE2 EP2受體特異性拮抗劑---AH6809和PGE2 EP4受體特異性拮抗劑---AH23848來(lái)處理NR8383大鼠巨噬細(xì)胞,通過(guò)觀察NR8383大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)水平的變化以及處理后NR8383大鼠巨噬細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)HUVECs遷移和成管作用的影響,來(lái)進(jìn)一步證實(shí),PGE2是通過(guò)作用于NR8383大鼠巨噬細(xì)胞表面的特異性受體,從而增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管生成的作用。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NR8383大鼠巨噬細(xì)胞,以1 nmol/L PGE2處理的NR8383大鼠巨噬細(xì)胞為對(duì)照組,以lnmol/L PGE2+10nmol/L PGE2 EP2受體拮抗劑AH6809+10nmol/L PGE2 EP4受體拮抗劑AH23848處理的NR8383大鼠巨噬細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組。培養(yǎng)5天后,分別進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá)水平；采用Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Matrigel基質(zhì)膠細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs趨化和成管的能力。具體實(shí)驗(yàn)方法均如上文所述。結(jié)果：1.PGE2特異性受體拮抗劑可以抑制PGE2增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)的作用。研究發(fā)現(xiàn),與未采用AH6809和AH23848處理的對(duì)照組相比,AH6809和AH23848處理組NR8383大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá)水平發(fā)生顯著降低(P0.05)。提示AH6809和AH23848處理可以顯著抑制PGE2對(duì)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用。2.PGE2特異性受體拮抗劑可以抑制PGE2增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs遷移的能力。研究發(fā)現(xiàn),與未采用AH6809和AH23848處理的對(duì)照組相比,AH6809和AH23848處理組HUVECs發(fā)生跨膜遷移的細(xì)胞數(shù)顯著減少(P0.000)。提示PGE2處理可以顯著抑制PGE2對(duì)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs趨化遷移能力的增強(qiáng)作用。3.PGE2特異性受體拮抗劑可以抑制PGE2增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs成管的能力。研究發(fā)現(xiàn),與未采用AH6809和AH23848處理的對(duì)照組相比,AH6809和AH23848處理組HUVECs形成管狀結(jié)構(gòu)的面積顯著減少(P0.000)。提示PGE2處理可以顯著抑制PGE2對(duì)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs成管能力的增強(qiáng)作用。討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)應(yīng)用PGE2特異性受體拮抗劑處理NR8383大鼠巨噬細(xì)胞后,可以顯著抑制PGE2提高NR8383大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)的效應(yīng),也可以顯著拮抗PGE2增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)]HUVECs遷移和成管的能力,抑制PGE2促進(jìn)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管新生的效應(yīng)。因此研究結(jié)果證實(shí),PGE2與NR8383大鼠巨噬細(xì)胞存在相互作用,PGE2是通過(guò)直接作用于NR8383大鼠巨噬細(xì)胞表面對(duì)應(yīng)的受體,來(lái)增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管生成的效應(yīng)。進(jìn)一步提示,PGE2是調(diào)控巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管新生的重要活性分子,為后續(xù)進(jìn)一步探究圍著床期女性生殖系統(tǒng)中PGE2是否是參與女性生殖系統(tǒng)局部巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管新生活動(dòng)的重要調(diào)控因子提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：胚胎著床 子宮內(nèi)膜容受性 NR8383大鼠巨噬細(xì)胞 前列腺素E2 血管生成
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R321
【目錄】：

• 摘要3-14
• ABSTRACT14-29
• 前言29-35
• 第一章 PGE2對(duì)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞株VEGF mRNA表達(dá)的影響35-43
• 1. 材料36-37
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料36
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器36
• 1.3 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑36-37
• 2. 方法37-40
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)37
• 2.2 熒光定量PCR37-40
• 2.3 統(tǒng)計(jì)分析40
• 3. 結(jié)果40-41
• 3.1 不同濃度PGE2處理下NR8383大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA的表達(dá)水平40-41
• 4. 討論41-43
• 第二章 PGE2對(duì)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞株促進(jìn)HUVECs遷移能力的影響43-50
• 1. 材料43-44
• 1.1 細(xì)胞來(lái)源43
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器43-44
• 1.3 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑44
• 2. 方法44-46
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)44-45
• 2.2 Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)45-46
• 2.3 統(tǒng)計(jì)分析46
• 3. 結(jié)果46-48
• 3.1 PGE2可以增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs遷移的能力46-47
• 3.2 NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs遷移的能力與PGE2處理的能力呈正相關(guān)性47-48
• 4. 討論48-50
• 第三章 PGE2對(duì)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞株促進(jìn)HUVECs成管能力的影響50-57
• 150-51
• 1.1 細(xì)胞來(lái)源50
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器50-51
• 1.3 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑51
• 2. 方法51-53
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)51-52
• 2.2 Matrigel基質(zhì)膠細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)52-53
• 2.3 統(tǒng)計(jì)分析53
• 3. 結(jié)果53-55
• 3.1 PGE2可以增強(qiáng)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs成管的能力53-54
• 3.2 PGE2對(duì)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs成管能力的效應(yīng)與PGE2處理濃度呈正相關(guān)54-55
• 4. 討論55-57
• 第四章 PGE2特異性受體拮抗劑可以抑制PGE2對(duì)巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管生成的效應(yīng)57-71
• 1. 材料58-60
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料58
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器58-60
• 2. 方法60-65
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)60
• 2.2 熒光定量PCR60-63
• 2.3 Transwell小室細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)63-64
• 2.4 Matrigel基質(zhì)膠細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)64-65
• 2.5 統(tǒng)計(jì)分析65
• 3. 結(jié)果65-69
• 3.1 PGE2特異性受體拮抗劑可以抑制PGE2對(duì)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)水平調(diào)節(jié)的效應(yīng)65-66
• 3.2 PGE2特異性受體拮抗劑可以抑制PGE2對(duì)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs趨化遷移的作用66-68
• 3.3 PGE2特異性受體拮抗劑可以抑制PGE2對(duì)NR8383大鼠巨噬細(xì)胞促進(jìn)HUVECs成管的作用68-69
• 4. 討論69-71
• 全文小結(jié)71-73
• 參考文獻(xiàn)73-79
• 主要中英文縮略詞表79-80
• 碩士研究生期間發(fā)表論文情況80-81
• 致謝81-82

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  本文關(guān)鍵詞：PGE2對(duì)NR8383巨噬細(xì)胞株促進(jìn)HUVEC細(xì)胞遷移和成管能力調(diào)控作用的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：456725