本文關(guān)鍵詞：穿膜肽EGFP的構(gòu)建及其對(duì)人成熟精子的穿膜活性鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的構(gòu)建穿膜肽TAT與EGFP融合蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng),研究該融合蛋白對(duì)人成熟精子的穿膜作用和對(duì)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響。方法以p EGFP-N1載體為模板,設(shè)計(jì)N端和C端含有TAT序列的引物,用PCR技術(shù)擴(kuò)增TAT-EGFP和EGFP-TAT基因,擴(kuò)增產(chǎn)物插入載體p ET28a,構(gòu)建成重組質(zhì)粒p ET28a-TAT-EGFP和p ET28a-EGFPTAT。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DE3中,IPTG誘導(dǎo)TAT-EGFP和EGFP-TAT融合蛋白表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化后SDS-PAGE電泳鑒定。將融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT分別加入正常人精子中孵育,熒光顯微鏡觀察融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT穿膜情況。結(jié)果成功構(gòu)建了高表達(dá)重組質(zhì)粒p ET28a-TAT-EGFP和p ET28aEGFP-TAT,純化了分子質(zhì)量約為32 k D的融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT。融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT在正常人成熟精子中有穿膜作用。不同濃度的融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT對(duì)正常人成熟精子存活率及運(yùn)動(dòng)參數(shù)無(wú)明顯影響。結(jié)論通過(guò)對(duì)融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT表達(dá)純化及活性分析,證實(shí)穿膜肽TAT在精子中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用,為將來(lái)精子研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【作者單位】： 江西省婦幼保健院輔助生殖中心;南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院;
【關(guān)鍵詞】： 細(xì)胞穿膜肽 綠色熒光蛋白 精子
【基金】：江西省衛(wèi)生計(jì)生委普通科技計(jì)劃資助課題(20151119)
【分類號(hào)】：R321
【正文快照】： 近年來(lái)研究熱點(diǎn)之一細(xì)胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides,CPPs),也稱為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(proteintranslocation domain,PTD)或“特洛伊木馬”肽(Trojan horse peptides)或轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(transductionpeptide)等,是一種高度陽(yáng)離子短肽。穿膜肽具有強(qiáng)大的運(yùn)載潛能[1],可以通過(guò)化學(xué)結(jié)合或基

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本文編號(hào)：440384