目的結(jié)合熒光染料EvaGreen與環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)探索快速檢測類鼻疽伯克霍爾德菌的可行性。方法根據(jù)類鼻疽伯克霍爾德菌filc基因片段設(shè)計了LAMP引物,利用熒光染料EvaGreen建立實時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,RealAmp),優(yōu)化反應(yīng)條件,擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定。通過類鼻疽伯克霍爾德菌和其他致病菌驗證特異性,比較RealAmp與普通LAMP技術(shù)的敏感度,并測定人工污染土壤模擬樣本的檢出限。結(jié)果恒溫63℃條件下,20～60 min即可完成RealAmp檢測;利用該方法檢測類鼻疽伯克霍爾德菌為陽性,其余致病菌如鼠疫桿菌、布魯氏桿菌、大腸桿菌等13株參考菌株及蜱蟲的DNA(含大量假單胞菌屬細菌)呈擴增陰性;RealAmp技術(shù)檢測類鼻疽伯克霍爾德菌核酸的靈敏度為10² CFU/mL,檢測克隆株質(zhì)粒的靈敏度可達10¹ copies/μL,比...

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圖１ＲｅａｌＡｍｐ檢測類鼻疽伯克霍爾德菌Ｆｉ．１ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉｂＲｅａｌ－１：陽性對照２：陰性對照

２．１ＲｅａｌＡｍｐ檢測類鼻疽伯克霍爾德菌方法的建立如圖１所示，當反應(yīng)進行至２５個循環(huán)（１ｍｉｎ／循環(huán)）時，陽性對照管的熒光強度大幅度增加，熒光曲線斜率增加，當反應(yīng)進行至４０個循環(huán)，熒光信號增加強度逐漸變緩，直至反應(yīng)結(jié)束，儀器判定為陽性結(jié)果，說明發(fā)生了擴增反應(yīng)。陰性對照管熒光曲線....

圖２電泳驗證ＲｅａｌＡｍｐ擴增產(chǎn)物Ｍ：１００ｂｐｍａｒｋｅｒ；１：陽性對照；２：陰性對照

曲線斜率增加，當反應(yīng)進行至４０個循環(huán)，熒光信號增加強度逐漸變緩，直至反應(yīng)結(jié)束，儀器判定為陽性結(jié)果，說明發(fā)生了擴增反應(yīng)。陰性對照管熒光曲線一直處于平滑的狀態(tài)，直到反應(yīng)終止也沒有曲線斜率的變化，儀器判定為陰性結(jié)果，說明沒有發(fā)生擴增反應(yīng)。１：陽性對照２：陰性對照圖１ＲｅａｌＡｍｐ檢測類....

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