背景：大腸桿菌來源RNase P為一催化tRNA前體5′端成熟的核糖蛋白復(fù)合體，催化核心M1 RNA由377個(gè)核苷酸組成，可在一定鹽離子環(huán)境下體外單獨(dú)對(duì)RNA底物進(jìn)行特異切割。RNase P為結(jié)構(gòu)識(shí)別酶，其底物至少包括兩個(gè)要件：1 游離NCCA-3′末端；2 特異互補(bǔ)的雙鏈RNA區(qū)域。與底物特異互補(bǔ)的RNA片段稱為GS，將GS與M1 RNA共價(jià)連接為M1GS，是具備自我引導(dǎo)和序列特異切割能力的核酶。 目的：篩選出靶定人巨細(xì)胞病毒(HCMV)磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的高特異性、高活性的M1GS核酶，為進(jìn)一步研究以RNase P為基礎(chǔ)的反義RNA技術(shù)抑制病毒基因表達(dá)奠定理論基礎(chǔ)。 方法：從HCMV磷酸轉(zhuǎn)移酶基因UL97序列中搜索出8個(gè)適合GS互補(bǔ)的靶位，克隆構(gòu)建得8個(gè)M1GS核酶；將UL97基因中靶位集中的后1／4部分克隆至pGEM3z質(zhì)粒。對(duì)M1GS DNA模板和兩個(gè)底物模板分別進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得核酶M1GS及帶有³²P放射性標(biāo)記的兩個(gè)底物片段的RNA。將M1GS與相對(duì)應(yīng)的底物片段RNA在體外切割緩沖液中混合反應(yīng)后電泳分離，自顯影檢測。 結(jié)果：從自顯影...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖4MIRNA三級(jí)結(jié)構(gòu)

成+378/+379RNA;途徑11卻直接就形成+378/+379RNAMlRNA還多一個(gè)或兩個(gè)核營酸的剪切產(chǎn)物)。隨后其MlRNA。(圖2)【’〕_產(chǎn)竺里科3B5/+38。，間體一、，人廠一3了日l+3了gR潤A一-一今成熟朋1RN人途徑n圖2成熟MlRNA形成過程征:二級(jí)結(jié)構(gòu)....

圖12Pu97重組質(zhì)粒鑒定電泳2EeoRI+Sall雙酶切PU97;3酶切PU97;5PU97重組質(zhì)粒;6Sall酶切PU97;Marker

巨細(xì)胞病毒磷酸轉(zhuǎn)移酶基因mRNA片段的體于體外轉(zhuǎn)錄。T7和SP6雙啟動(dòng)子雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果顯示PCR獲得linel)，此帶與PU97質(zhì)粒雙酶PU97質(zhì)粒單酶切后，產(chǎn)生了大(圖12line31ine4)。電泳結(jié)組子PU97進(jìn)行了基因的全長測序

圖14突變Marker;2MIGS重組質(zhì)粒;MIGS克隆質(zhì)粒的鑒定電泳3KPnl+Hindlll雙酶切重組子;4酶切重組質(zhì)粒;5Kpnl單酶切重組質(zhì)粒;6AD(MIGsT3)片段pCRHind111單產(chǎn)物;7CD

0004000300020001600100020001600100051739623075(50(圖14突變Marker;2MIGS重組質(zhì)粒;MIGS克隆質(zhì)粒的鑒定電泳3KPnl+Hindlll雙酶切重組子;4酶切重組質(zhì)粒;5Kpnl單酶切重組質(zhì)粒;6AD(MIGsT3)片段p....

圖1，F(xiàn)u，/一u乙里組從私金正電泳Marker:2EeoRI+Sall雙酶切PU97一DZ重組質(zhì)粒;3Sall酶切PU97一DZ重組質(zhì)粒;4EeoRI酶切PU97;5PU97一DZ重組質(zhì)粒;6PU97一DZPCR產(chǎn)物;7Marker

圖18uL97DZ片段亞克隆技質(zhì)粒的鑒定和雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果顯示PCR19line6)，此帶與PU97一DZeZ)，PU97一DZ質(zhì)粒單酶切后，大小相符(圖19line31in1234567

本文編號(hào)：3920360