本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白的原核表達(dá)、純化及免疫原性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)俗稱結(jié)核桿菌,是引起結(jié)核病的致病菌,目前仍然是一種高死亡率的慢性傳染性疾病。1998年結(jié)核分枝桿菌全基因組測序工作完成,發(fā)現(xiàn)PE和PPE兩大核心蛋白家族,整個基因組中約有10%的開放讀框編碼這兩大家族。由于其N端具有保守的Pro-Glu,PE和Pro-Pro-G lu,PPE基序,因此被命名為PE/PPE蛋白家族。PE家族共有99個成員,每個成員的N端均具有由110個氨基酸殘基組成的保守序列。通過生物信息學(xué)分析PE蛋白家族的特點,發(fā)現(xiàn)其蛋白家族中主要富含以GGXGG的基序,因此我們推測GGXGG為主要抗原表位。PPE家族共有69個成員,每個成員N端均具有由180個氨基酸殘基組成的保守序列。目前這兩大家族的結(jié)構(gòu)和功能尚不明確,但推測與細(xì)菌毒力有關(guān),在抗原變異及免疫逃逸過程中起重要作用。目前,各種MTB特異性抗原不斷被研究發(fā)現(xiàn),為結(jié)核抗體的檢測奠定了良好的基礎(chǔ)。本研究通過原核表達(dá)多種MTB特異性抗原,分析比較其特異性及敏感性,探討不同抗原的反應(yīng)模式。本研究分為以下兩個部分:第一部分:結(jié)核分枝桿菌PE及PPE家族相關(guān)基因的體外合成,原核表達(dá)及免疫原性分析通過GenBank數(shù)據(jù)庫查詢,分別從結(jié)核分枝桿菌PE及PPE蛋白家族中各選擇一段高度保守序列,翻譯成經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化的三段序列PE-PGRS33(110aa)、PPE38(180aa),PE-PGRS52(637-731aa),構(gòu)建并原核表達(dá)這三段序列。具體方法如下:分別獲得PE-PGRS33(110aa)、PPE38(180aa),PE-PGRS52(637-731aa)基因片段,利用OE-PCR原理設(shè)計特異性引物進行體外基因合成PE-PGRS33(110aa)、ppe38(180aa),pe-pgrs52(637-731aa)三個片段。將合成后的三個片段利用t/a克隆法克隆至pmd18-t載體鑒定測序。將測序正確的序列與原核表達(dá)載體pet32a連接,構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒:pet32a/pe-pgrs33(110aa)、pet32a/ppe38(180aa),pet32a/pe-pgrs52(637-731aa),將上述3種原核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入e.colibl21(de3)中,經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達(dá),其中,pet32a/pe-pgrs33(110aa)、pet32a/ppe38(180aa)未表達(dá)成功,pet32a/pe-pgrs52(637-731aa)小量誘導(dǎo)可見明顯表達(dá)條帶,其相對分子量約為28kd,用ni-nta親和層析法純化目的融合蛋白。通過12%sds-page電泳分析,可見分子量約為28kd左右的特異條帶,大小與理論值相符。表明本研究成功構(gòu)建并表達(dá)出pet32a/pe-pgrs52(637-731aa)融合蛋白。將純化的目的蛋白免疫balb/c小鼠,制備抗血清,elisa檢測結(jié)果顯示pet32a/pe-pgrs52(637-731aa)和peptide/pe-pgrs52(637-731aa)與免疫兔血清呈特異性反應(yīng),其igg抗體滴度分別為1:32000和1:16000,與pet32a蛋白僅有較弱的結(jié)合反應(yīng)。說明我們設(shè)計的這一段以ggngg為抗原表位的序列在體外基因合成表達(dá)表達(dá),純化的蛋白具有很好的免疫原性,同時也反映了ggngg是抗原決定中心,為今后結(jié)核病初期診斷試劑盒和疫苗的研究提供參考。第二部分結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白的基因克隆、原核表達(dá)及免疫原性初步分析通過genbank數(shù)據(jù)庫查詢6種結(jié)核分枝桿菌核苷酸序列,根據(jù)查詢的核苷酸序列設(shè)計擴增引物,在上下游引物中分別加入合適的酶切位點及酶切位點保護堿基,以h37rv基因組為模板分別擴增上述6種基因。將擴增產(chǎn)物回收純化,然后與pmd-18t載體連接,pcr鑒定并測序,將測序正確的質(zhì)粒與原核表達(dá)載體pet32a連接,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒,將這6種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至e.colibl21(de3)中,經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達(dá),用合適的方法純化這6種蛋白。elisa檢測結(jié)果顯示,以80份結(jié)核患者血清以及96份正常成年人血清為樣本,通過間接elisa方法檢測各個蛋白的抗原性,結(jié)果顯示pet32a/pe-pgrs52(637-731aa)的特異性為97.9%,敏感性為37.5%;與rv0934,rv0831c聯(lián)合檢測后,敏感性明顯提高;這表明pet32a/pe-pgrs52(637-731aa)作為單一抗原用于血清學(xué)檢測意義不大,但可以作為結(jié)核聯(lián)合診斷的備選抗原�？偨Y(jié):1.本研究成功構(gòu)建3種結(jié)核分枝桿菌特異性原核表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)E.coli誘導(dǎo)表達(dá),獲得了1種結(jié)核分枝桿菌PE家族的一段截短蛋白。2.所構(gòu)建的PE-PGRS52蛋白較好的保留了免疫原性。3.本研究成功構(gòu)建并表達(dá)了6種結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白,重組的6種蛋白利用間接ELISA法進行了免疫原性分析,初步的研究結(jié)果為進一步的分析和篩選臨床用于檢測結(jié)核病提供了一定的實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 PE PPE 特異性 敏感性
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-15
• 第一部分:結(jié)核分枝桿菌PE及PPE家族相關(guān)基因的體外合成,原核表達(dá)及免疫原性分析15-37
• 引言15-17
• 材料與方法17-29
• 實驗結(jié)果29-35
• 討論35-37
• 第二部分 結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白的基因克隆、原核表達(dá)及免疫原性初步分析37-45
• 材料與方法37-38
• 實驗方法38-40
• 實驗結(jié)果40-43
• 討論43-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 附錄49-50
• 致謝50-51
• 綜述51-58
• 參考文獻(xiàn)56-58

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本文編號：390337