發(fā)布時(shí)間：2017-05-17 17:17

  本文關(guān)鍵詞：TALEN技術(shù)構(gòu)建斑馬魚先天性心臟病gata4基因敲除模型的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 先天性心臟病(CHD)是人類一種非常普遍和具有破壞性的出生缺陷性疾病,其發(fā)生與gata4基因突變有關(guān)。gata4參與調(diào)控心肌細(xì)胞中某些特定基因的表達(dá),對(duì)心肌細(xì)胞的形成、心臟前體細(xì)胞的遷移和分化、心瓣膜及間隔發(fā)育等具有重要作用。基因敲除技術(shù)構(gòu)建gata4基因敲除的動(dòng)物模型有助于人類先天性心臟病致病機(jī)制和治療的進(jìn)一步研究。類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)介導(dǎo)的靶向修飾技術(shù)是目前廣泛使用的成熟的基因敲除技術(shù),它主要含有兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域：特異性識(shí)別核酸的靶點(diǎn)識(shí)別域和切斷DNA序列的核酸酶功能結(jié)構(gòu)域。人工構(gòu)建針對(duì)gata4基因第一外顯子的重組核酸酶TALEN,在體內(nèi)對(duì)特定位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂,利用細(xì)胞自身DNA損傷后的NHJE引入基因突變、敲除或敲入,實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)修飾的目的,并建立斑馬魚先天性心臟病gata4基因敲除的動(dòng)物模型。方法 采用生物信息學(xué)方法分析斑馬魚gata4基因的編碼序列,利用靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)軟件選擇合適的打靶位點(diǎn),針對(duì)第一外顯子設(shè)計(jì)了一對(duì)靶點(diǎn)。使用單元組裝法克隆構(gòu)建特異性TALE靶點(diǎn)結(jié)合域,組裝完成后通過菌液PCR、測(cè)序驗(yàn)證TALE是否組裝正確。將TALE靶點(diǎn)結(jié)合域克隆到真核表達(dá)載體pCS2-PEAS和pCS2-PERR中,得到gata4基因的左、右半位點(diǎn)的重組核酸酶質(zhì)粒,通過菌液PCR、酶切、測(cè)序驗(yàn)證打靶載體是否正確。線性化打靶載體DNA,使用SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒將其轉(zhuǎn)錄成mRNAs,通過顯微注射的方式注入斑馬魚單細(xì)胞期受精卵中,酶切法檢測(cè)TALEN的體內(nèi)活性。待注射的斑馬魚性成熟后,通過逐條剪尾、酶切檢測(cè)發(fā)生基因突變的斑馬魚,TA克隆測(cè)序確認(rèn)突變體的基因型,篩選出gata4基因敲除的斑馬魚。結(jié)果 菌液PCR、酶切、測(cè)序結(jié)果均證實(shí)成功地構(gòu)建出了正確的針對(duì)gata4第一外顯子左、右半位點(diǎn)的重組核酸酶,斑馬魚胚胎體內(nèi)活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TALEN的效率為35.18%,通過逐條剪尾、PCR、酶切法檢測(cè)成功地篩選出了19條gata4基因發(fā)生突變的斑馬魚,測(cè)序結(jié)果顯示斑馬魚突變體產(chǎn)生了不同片段大小、不同位置的gata4基因敲除。結(jié)論 成功構(gòu)建gata4基因敲除的斑馬魚模型,為進(jìn)一步研究人類gata4基因突變引起先天性心臟病的致病機(jī)制及治療研究提供了良好的動(dòng)物模型。
【關(guān)鍵詞】：類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶 斑馬魚 先天性心臟病 gata4基因 動(dòng)物模型
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R541.1;R-332
【目錄】：

• 摘要7-8
• Abstract8-9
• 前言9-14
• 1、斑馬魚概述9
• 2、斑馬魚胚胎心臟發(fā)育概述9-10
• 3、先天性心臟病與gata4基因概述10-11
• 4、TALEN技術(shù)11-13
• 4.1 TALEN技術(shù)簡(jiǎn)介11
• 4.2 TALEN技術(shù)的原理11-12
• 4.3 TALEN的構(gòu)建方法12-13
• 4.4 TALEN技術(shù)應(yīng)用13
• 5、CRISPR/CAS9技術(shù)13
• 6、本文的研究意義13-14
• 材料和方法14-27
• 實(shí)驗(yàn)材料14-16
• 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物14
• 2、菌種、質(zhì)粒14
• 3、工具酶14
• 4、試劑盒14
• 5、其他試劑14
• 6、主要儀器及耗材14-15
• 7、主要試劑配制15-16
• 實(shí)驗(yàn)方法16-27
• 1、基本方法16-24
• 1.1 斑馬魚gata4基因的提取16
• 1.2 引物設(shè)計(jì)與合成16-17
• 1.3 PCR擴(kuò)增目的片段17
• 1.4 電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物17-18
• 1.5 普通PCR產(chǎn)物純化18
• 1.6 質(zhì)粒的提取18-19
• 1.7 質(zhì)粒的雙酶切鑒定19
• 1.8 普通瓊脂糖凝膠DNA回收19-20
• 1.9 連接20
• 1.10 氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)胞20-21
• 1.11 轉(zhuǎn)化21
• 1.12 陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定21
• 1.13 體外轉(zhuǎn)錄21-22
• 1.14 斑馬魚飼養(yǎng)及繁殖22-23
• 1.14.1 斑馬魚的飼養(yǎng)環(huán)境22
• 1.14.2 斑馬魚飼料22-23
• 1.14.3 斑馬魚的雌雄鑒別23
• 1.14.4 受精產(chǎn)卵23
• 1.14.5 胚胎孵化23
• 1.14.6 幼魚的培育23
• 1.15 顯微注射23-24
• 1.16 測(cè)序24
• 2、TALEN實(shí)驗(yàn)流程24-27
• 2.1 敲除靶點(diǎn)的選擇與確認(rèn)24-25
• 2.2 采用“單元組裝法”構(gòu)建pMD-TALE載體25
• 2.3 構(gòu)建TALEN表達(dá)終載體25-26
• 2.4 TALENs質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄26
• 2.5 TALEN體內(nèi)活性檢測(cè)26
• 2.6 斑馬魚gata4敲除動(dòng)物模型檢測(cè)26-27
• 結(jié)果與分析27-38
• 1、斑馬魚gata4基因的靶點(diǎn)分析結(jié)果27
• 2、gata4基因擴(kuò)增與敲除靶點(diǎn)比對(duì)27-28
• 3、“單元組裝法”構(gòu)建pMD-TALE載體28-32
• 3.1 左半位點(diǎn)(pMD-TALE-L)、右半位點(diǎn)(pMD-TALE-R)構(gòu)建方案28-29
• 3.2 左半位點(diǎn)(pMD-TALE-L)、右半位點(diǎn)(pMD-TALE-R)構(gòu)建過程29-32
• 4、pCS2-PEAS-L和pCS2-PERR-R終載體的構(gòu)建與鑒定32-33
• 5、TALEN體內(nèi)活性檢測(cè)33-35
• 6、斑馬魚gata4敲除動(dòng)物模型檢測(cè)35-38
• 6.1 酶切法檢測(cè)TALEN敲除效率35-36
• 6.2 F_0代基因型檢測(cè)36
• 6.3 斑馬魚胚胎心臟結(jié)構(gòu)觀察及心率的測(cè)量36-38
• 討論38-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-46
• 附錄1：綜述46-55
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 附錄2：中英文縮略詞表55-57
• 附錄3：所用載體信息57-58
• 附錄4：測(cè)序結(jié)果58-59
• 附錄5：個(gè)人簡(jiǎn)介59-60
• 致謝60-61

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 陳寶增;李鳳超;康現(xiàn)江;;實(shí)驗(yàn)室斑馬魚的繁育與養(yǎng)殖技術(shù)[J];河北漁業(yè);2008年04期

2 袁宗勤;于燕光;叢日浩;劉舟浩;馬睿;溫海深;;溫度對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育的影響研究[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年04期

3 ;Efficient and Specific Modifications of the Drosophila Genome by Means of an Easy TALEN Strategy[J];遺傳學(xué)報(bào);2012年05期

4 肖安;胡瑩瑩;王唯曄;楊志們;王展翔;黃鵬;佟向軍;張博;林碩;;人工鋅指核酸酶介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)[J];遺傳;2011年07期

5 沈延;肖安;黃鵬;王唯曄;朱作言;張博;;類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)[J];遺傳;2013年04期

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本文編號(hào)：374032