目的:利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立五指山小型豬近交系GGTA1/β4GalNT2雙基因敲除克隆豬。方法:設(shè)計(jì)合成靶向豬GGTA1和β4GalNT2基因的單導(dǎo)向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330質(zhì)粒為骨架,分別構(gòu)建GGTA1和β4GalNT2的Cas9打靶載體,轉(zhuǎn)染至近交系五指山小型豬胎兒成纖維細(xì)胞（porcine fetal fibroblast,PFF）中,通過(guò)G418藥物篩選和測(cè)序鑒定獲得雙基因敲除的單細(xì)胞克隆,然后利用體細(xì)胞克隆技術(shù)（somatic cell nuclear transfer,SCNT）獲得雙基因敲除的近交系五指山小型豬,并利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)克隆豬外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中αGal和Sd（a）抗原的表達(dá)。結(jié)果:成功構(gòu)建GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染后獲得雙基因敲除的近交系五指山小型豬PFF細(xì)胞克隆9個(gè)。SCNT成功獲得了10只五指山小型豬近交系雙基因敲除的克隆豬,其PBMC無(wú)αGal和Sd（a）抗原的表達(dá)。結(jié)論:CR... 

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 sgRNA的設(shè)計(jì)與CRISPR/Cas9載體構(gòu)建
        1.2.2 胚胎成纖維細(xì)胞的制備以及單細(xì)胞克隆的獲得與鑒定
        1.2.3 GGTA1/β4GalNT2雙基因敲除WZSP的制備與鑒定
        1.2.4 GGTA1和β4GalNT2抗原表達(dá)鑒定
    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2 結(jié)果
    2.1 CRISPR/Cas9敲除位點(diǎn)選擇和打靶載體構(gòu)建
    2.2 GGTA1和β4GalNT2雙基因敲除克隆的獲得與鑒定
    2.3 GGTA1-/-β4GalNT2-/-WZSP的制備與鑒定
    2.4 WZSP克隆豬體內(nèi)αGal和Sd (a) 抗原表達(dá)鑒定
3 討論
    3.1 近交系五指山雙基因敲除豬首次克隆成功, 具有較大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)
    3.2 CRISPR/Cas9一次性編輯2個(gè)基因


【參考文獻(xiàn)】：
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