目的制備結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）分泌蛋白Rv0674,篩選與Rv0674蛋白特異性結(jié)合的肽分子。方法用PCR從MTB（H37Rv）基因組中擴(kuò)增出Rv0674基因�？寺〉絧EASY-E1表達(dá)載體上,將測序驗(yàn)證正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E. coli BL21中,用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),Ni2+親和層析法純化目的蛋白。通過SDS-PAGE和Western blot鑒定后,將純化后的Rv0674蛋白包被到96孔板上,再利用噬菌體展示技術(shù),經(jīng)過連續(xù)4輪特異性親和篩選,對第4輪產(chǎn)物隨機(jī)挑取單獨(dú)的噬菌斑,提取基因組并測序,用SnapGene 4.1.4比對并翻譯多肽的基因序列。結(jié)果構(gòu)建了Rv0674序列正確的重組表達(dá)質(zhì)粒,獲得分子量約為26.5kD的可溶性Rv0674蛋白。從第4輪的洗脫物中,隨機(jī)挑選40個噬菌斑。測序結(jié)果可翻譯成10種多肽分子,其中重復(fù)19次的多肽序列為TSTMMMHMNL。結(jié)論通過噬菌體展示技術(shù)篩選到TSTMMMHMNL多肽序列,對Rv0674蛋白的親和力和特異性最好。 

【文章來源】：寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2019,41(06)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

淘選噬菌體滴度圖

與預(yù)期大小為780bp的Rv0674結(jié)果相符，見圖1。2.2Rv0674的純化純化的Rv0674蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定，獲得了大量的高純度的可溶性蛋白質(zhì)，其分子量略大于25kDa，與Rv0674預(yù)測的分子量26.5kDa一致，見圖2。2.3Rv0674特異性結(jié)合肽篩選2.3.1滴度測定以Rv0674為靶分子，每輪篩選后對收集到的噬菌體進(jìn)行滴度測定，見圖3。2.3.24輪篩選結(jié)果以Rv0674為靶分子，使噬菌體表面展示的隨機(jī)多肽與之結(jié)合，經(jīng)4輪“吸附-淘洗-洗脫-擴(kuò)增”后，第3輪得到的是第2輪的36.4倍，第4輪是第3輪的4倍；提示噬菌體得到明顯富集，見表1。2.4篩選結(jié)果從第4輪產(chǎn)物中隨機(jī)挑取40個噬菌體單克隆進(jìn)行核苷酸序列測定，結(jié)果表明2、3、4、5、10、13、17、19、20、21、22、25、26、27、28、29、32、35、36號共19個噬菌體所攜帶的核苷酸序列和翻譯出的多肽氨基序列相同，分別為ACCTCCACCAT－GATGATGCATATGAATCTT和TSTMMMHMNL，該類多肽實(shí)現(xiàn)了富集。同時也篩選到了其他9種多肽，提示這些多肽可能對Rv0674蛋白的親和力和特異性比較好，見表2。3討論TB是由MTB引起的危害全球人類健康的重大傳染性疾病之一，目前在用于臨床TB診斷的幾種方法中，雖然細(xì)菌學(xué)診斷一直是TB診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[9]，但耗時長，假陽性率高[10]。而血清學(xué)診斷簡單、快速、高效、低廉，成為近幾年來研究的熱點(diǎn)[11]，但單一的抗原檢測往往不能同時滿足高靈敏性和特異性的要求[12]。研究[13]發(fā)現(xiàn)，通過MTB分泌蛋白抗原T細(xì)胞表位展示的外源性多肽分子，將其應(yīng)用于TB的血清學(xué)診斷，能夠滿足快速、靈敏的診斷要求。感染MTB的病人，在出現(xiàn)臨床癥狀前幾個月甚至幾年就存在MTB分泌抗原的抗體。因此MTB分泌性蛋白的相關(guān)研究引起了越來越多的人關(guān)注，對多種分泌性蛋白如ESAT-6[14]

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]十六個結(jié)核分枝桿菌新抗原的抗原表位鑒定與評價[D]. 王雪枝.中國疾病預(yù)防控制中心 2017

碩士論文
[1]結(jié)核分枝桿菌模擬表位的篩選及其在結(jié)核病血清學(xué)診斷中的初步應(yīng)用[D]. 王麗.南華大學(xué) 2017
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