目的:構建微小RNA-186（miR-186）基因的海綿載體,建立穩(wěn)定敲減miR-186的EA.hy926細胞株。方法:化學合成miR-186海綿體序列,并克隆到慢病毒FV040表達載體上;采用lipofectamine 2000共轉染FV040-miR-186-sponge載體和慢病毒輔助包裝質粒到HEK293T細胞,包裝慢病毒,測定病毒滴度;FV040-control慢病毒作為對照組,FV040-miR-186-sponge作為實驗組,分別感染EA.hy926細胞,篩選穩(wěn)轉細胞株;采用熒光定量PCR（qPCR）法檢測空白對照組、FV040-control對照組及FV040-miR-186-sponge實驗組中EA.hy926細胞miR-186的相對表達水平。結果:測序結果顯示克隆的目的基因序列與設計的miR-186海綿體序列完全一致。在感染的EA.hy926細胞中觀察到綠色熒光蛋白（GFP）的表達。FV040-control包裝的慢病毒滴度為2×10⁸TU·mL^-1,FV040-miR-186-sponge組慢病毒滴度為6×10^... 

【文章來源】：吉林大學學報(醫(yī)學版). 2019,45(03)北大核心CSCD

【文章頁數】：6 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 細胞株和主要試劑
    1.2 PCR引物的設計和合成
    1.3 miR-186-sponge慢病毒載體的構建
    1.4 慢病毒包裝和病毒滴定
        1.4.1 慢病毒包裝
        1.4.2 病毒滴度測定
    1.5 miR-186-sponge穩(wěn)定轉染細胞系的建立和鑒定
        1.5.1 慢病毒感染EA.hy926細胞系
        1.5.2 熒光定量PCR (qPCR) 法檢測EA.hy926細胞中miR-186的相對表達水平
    1.6 統(tǒng)計學分析
2 結果
    2.1 miR-186海綿載體的構建和驗證
    2.2 病毒包裝、EA.hy926細胞感染和穩(wěn)轉細胞株的建立
    2.3 EA.hy926細胞中miR-186相對表達水平
3 討論



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