目的:構(gòu)建微小RNA-186（miR-186）基因的海綿載體,建立穩(wěn)定敲減miR-186的EA.hy926細(xì)胞株。方法:化學(xué)合成miR-186海綿體序列,并克隆到慢病毒FV040表達(dá)載體上;采用lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染FV040-miR-186-sponge載體和慢病毒輔助包裝質(zhì)粒到HEK293T細(xì)胞,包裝慢病毒,測(cè)定病毒滴度;FV040-control慢病毒作為對(duì)照組,FV040-miR-186-sponge作為實(shí)驗(yàn)組,分別感染EA.hy926細(xì)胞,篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株;采用熒光定量PCR（qPCR）法檢測(cè)空白對(duì)照組、FV040-control對(duì)照組及FV040-miR-186-sponge實(shí)驗(yàn)組中EA.hy926細(xì)胞miR-186的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果:測(cè)序結(jié)果顯示克隆的目的基因序列與設(shè)計(jì)的miR-186海綿體序列完全一致。在感染的EA.hy926細(xì)胞中觀察到綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)。FV040-control包裝的慢病毒滴度為2×10⁸TU·mL^-1,FV040-miR-186-sponge組慢病毒滴度為6×10^... 

【文章來(lái)源】：吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2019,45(03)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 細(xì)胞株和主要試劑
    1.2 PCR引物的設(shè)計(jì)和合成
    1.3 miR-186-sponge慢病毒載體的構(gòu)建
    1.4 慢病毒包裝和病毒滴定
        1.4.1 慢病毒包裝
        1.4.2 病毒滴度測(cè)定
    1.5 miR-186-sponge穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立和鑒定
        1.5.1 慢病毒感染EA.hy926細(xì)胞系
        1.5.2 熒光定量PCR (qPCR) 法檢測(cè)EA.hy926細(xì)胞中miR-186的相對(duì)表達(dá)水平
    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
2 結(jié)果
    2.1 miR-186海綿載體的構(gòu)建和驗(yàn)證
    2.2 病毒包裝、EA.hy926細(xì)胞感染和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立
    2.3 EA.hy926細(xì)胞中miR-186相對(duì)表達(dá)水平
3 討論



本文編號(hào)：3625289