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EV71可溶性2C蛋白的原核表達(dá)及純化

發(fā)布時(shí)間:2022-02-04 22:04
  目的:本課題采用生物信息學(xué)方法、選用不同表達(dá)載體克隆表達(dá)EV71 2C蛋白,最終獲得高純度、性狀均一、可正確折疊的可溶性蛋白,為蛋白質(zhì)的晶體篩選奠定基礎(chǔ)。方法:1.EV71生物信息學(xué)分析從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載EV71(200804株)的2C的基因序列和氨基酸序列,采用Protparam軟件、Protean軟件、Top Pred 2服務(wù)器、Pfam軟件、SMART軟件分別對(duì)EV71 2C蛋白的基本理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、疏水性、核心結(jié)構(gòu)域等信息進(jìn)行初步預(yù)測(cè),根據(jù)氨基酸的疏水性分析結(jié)果和功能結(jié)構(gòu)域分布,設(shè)計(jì)6個(gè)不同長(zhǎng)度的氨基酸片段。2.重組EV71 2C截短片段基因克隆以EV71全長(zhǎng)基因組A12質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)引物:2C-91aa-Bam HI-5、2C-118aa-Bam HI-5、2C-256aa-Xho I-3T、2C-296aa-Xho I-3T、2C-316aa-Xho I-3T。對(duì)上述截取的6個(gè)2C片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增后獲得的DNA片段分別連接至帶有His標(biāo)簽的p Gl01載體和帶有MBP促溶標(biāo)簽的psj8載體上,構(gòu)建12個(gè)重組質(zhì)粒:6個(gè)包含p Gl01載體-2C截短片段的重組... 

【文章來(lái)源】:濟(jì)南大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】:74 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】:碩士

【文章目錄】:
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 EV71概述
    1.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)在研究病毒致病機(jī)制中的意義
    1.3 EV71蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展
        1.3.1 EV71衣殼蛋白
        1.3.2 EV71功能蛋白
    1.4 2C蛋白的研究現(xiàn)狀
        1.4.1 膜結(jié)合功能
        1.4.2 RNA結(jié)合活性
        1.4.3 NTPase活性
        1.4.4 與病毒衣殼蛋白VP3互作
        1.4.5 解旋酶活性
        1.4.6 其他功能
    1.5 獲得可溶蛋白是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的關(guān)鍵
    1.6 本課題研究的研究?jī)?nèi)容和意義
第二章 實(shí)驗(yàn)材料及儀器
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 生物信息學(xué)軟件
        2.1.2 驗(yàn)菌株、載體
        2.1.3 試劑及工具酶
        2.1.4 常用試劑配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
第三章 EV712C蛋白生物信息學(xué)分析及截短片段設(shè)計(jì)
    3.1 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1.1 生物信息學(xué)分析
        3.1.2 片斷設(shè)計(jì)的基本原則
    3.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果及片段截取
        3.2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果
        3.2.2 片段截取
    3.3 討論
第四章 EV712C截短片段的基因克隆
    4.1 實(shí)驗(yàn)方法
        4.1.1 重組EV71 pGl01/PSJ8載體-2C截短片段克隆表達(dá)
    4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.2.1 重組EV71 pGl01載體-2C截短片段、psj8載體-2C截短PCR擴(kuò)增結(jié)果
        4.2.2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果
    4.3 討論
第五章 EV712C截短蛋白的表達(dá)、純化和晶體普篩
    5.1 實(shí)驗(yàn)方法
        5.1.1 pGl01載體-2C截短蛋白及psj8載體-2C截短蛋白的表達(dá)
        5.1.2 pGl01載體-2C截短蛋白及psj8載體-2C截短蛋白純化
        5.1.3 蛋白質(zhì)晶體培養(yǎng)
    5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.2.1 蛋白質(zhì)表達(dá)及可溶性分析
        5.2.2 psj8載體-2C截短蛋白M1及M4的分子篩層析純化
    5.3 討論
第六章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】:
期刊論文
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[2]EV71非結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能及其為靶點(diǎn)的藥物研究進(jìn)展[J]. 秦咸蘊(yùn),林霖,楊燕,張書(shū)香,孔建強(qiáng),程克棣,趙云峰,王偉.  藥學(xué)學(xué)報(bào). 2011(07)
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本文編號(hào):3614022

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