目的:本課題采用生物信息學(xué)方法、選用不同表達載體克隆表達EV71 2C蛋白,最終獲得高純度、性狀均一、可正確折疊的可溶性蛋白,為蛋白質(zhì)的晶體篩選奠定基礎(chǔ)。方法:1.EV71生物信息學(xué)分析從NCBI數(shù)據(jù)庫下載EV71（200804株）的2C的基因序列和氨基酸序列,采用Protparam軟件、Protean軟件、Top Pred 2服務(wù)器、Pfam軟件、SMART軟件分別對EV71 2C蛋白的基本理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、疏水性、核心結(jié)構(gòu)域等信息進行初步預(yù)測,根據(jù)氨基酸的疏水性分析結(jié)果和功能結(jié)構(gòu)域分布,設(shè)計6個不同長度的氨基酸片段。2.重組EV71 2C截短片段基因克隆以EV71全長基因組A12質(zhì)粒為模板,設(shè)計引物:2C-91aa-Bam HI-5、2C-118aa-Bam HI-5、2C-256aa-Xho I-3T、2C-296aa-Xho I-3T、2C-316aa-Xho I-3T。對上述截取的6個2C片段進行PCR擴增,將擴增后獲得的DNA片段分別連接至帶有His標簽的p Gl01載體和帶有MBP促溶標簽的psj8載體上,構(gòu)建12個重組質(zhì)粒:6個包含p Gl01載體-2C截短片段的重組... 

【文章來源】：濟南大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 EV71概述
    1.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)在研究病毒致病機制中的意義
    1.3 EV71蛋白質(zhì)組學(xué)研究進展
        1.3.1 EV71衣殼蛋白
        1.3.2 EV71功能蛋白
    1.4 2C蛋白的研究現(xiàn)狀
        1.4.1 膜結(jié)合功能
        1.4.2 RNA結(jié)合活性
        1.4.3 NTPase活性
        1.4.4 與病毒衣殼蛋白VP3互作
        1.4.5 解旋酶活性
        1.4.6 其他功能
    1.5 獲得可溶蛋白是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的關(guān)鍵
    1.6 本課題研究的研究內(nèi)容和意義
第二章 實驗材料及儀器
    2.1 實驗材料
        2.1.1 生物信息學(xué)軟件
        2.1.2 驗菌株、載體
        2.1.3 試劑及工具酶
        2.1.4 常用試劑配制
    2.2 實驗儀器
第三章 EV712C蛋白生物信息學(xué)分析及截短片段設(shè)計
    3.1 實驗方法
        3.1.1 生物信息學(xué)分析
        3.1.2 片斷設(shè)計的基本原則
    3.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果及片段截取
        3.2.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果
        3.2.2 片段截取
    3.3 討論
第四章 EV712C截短片段的基因克隆
    4.1 實驗方法
        4.1.1 重組EV71 pGl01/PSJ8載體-2C截短片段克隆表達
    4.2 實驗結(jié)果
        4.2.1 重組EV71 pGl01載體-2C截短片段、psj8載體-2C截短PCR擴增結(jié)果
        4.2.2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果
    4.3 討論
第五章 EV712C截短蛋白的表達、純化和晶體普篩
    5.1 實驗方法
        5.1.1 pGl01載體-2C截短蛋白及psj8載體-2C截短蛋白的表達
        5.1.2 pGl01載體-2C截短蛋白及psj8載體-2C截短蛋白純化
        5.1.3 蛋白質(zhì)晶體培養(yǎng)
    5.2 實驗結(jié)果
        5.2.1 蛋白質(zhì)表達及可溶性分析
        5.2.2 psj8載體-2C截短蛋白M1及M4的分子篩層析純化
    5.3 討論
第六章 結(jié)論
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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