發(fā)布時(shí)間：2022-01-14 13:04

　　目的:構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）及人抑瘤素M（oncostatin M,OSM）基因的人胚胎成纖維細(xì)胞,將其作為飼養(yǎng)層細(xì)胞,研究其對(duì)臍帶血CD34⁺造血干/祖細(xì)胞（hematopoietic stem/progenitor cells,HSPC）體外擴(kuò)增的支持作用。方法:將本科室構(gòu)建和保存的人LIF和OSM基因真核表達(dá)載體pcDNA3.0-hLIF和pcDNA3.1（-）-hOSM經(jīng)鑒定后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)入WI-38人胚肺成纖維細(xì)胞系中進(jìn)行表達(dá),通過(guò)氨基糖苷類抗生素類似物G418篩選出能夠穩(wěn)定表達(dá)目的基因hLIF和hOSM的單細(xì)胞克隆。同時(shí)嘗試構(gòu)建這兩個(gè)基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)移,經(jīng)zeocin篩選后獲得基因修飾的人胚胎成纖維細(xì)胞株。采用分子生物學(xué)（RT-PCR法）和免疫學(xué)（ELISA法）的方法分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)目的基因能否在人胚胎成纖維細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)錄和翻譯,同時(shí)檢測(cè)真核細(xì)胞表達(dá)上清中的細(xì)胞因子hLIF及hOSM對(duì)靶細(xì)胞的生物學(xué)活性。然后將構(gòu)建成功... 

【文章來(lái)源】：蘇州大學(xué)江蘇省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：73 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

質(zhì)粒抽提后電泳圖

2 hLIF、hOSM 基因在 WI-38 細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的鑒定將實(shí)驗(yàn)組 WI38-pcDNA3.0-hLIF、WI38-pcDNA3.1(-)-hOSM 和空載體對(duì)照I-38 細(xì)胞總 RNA 進(jìn)行 RT-PCR，其產(chǎn)物經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，兩實(shí)驗(yàn)組出特異性亮帶，而空載體對(duì)照組則沒(méi)有相應(yīng)的條帶（如圖 1-3）。上述結(jié)果表明 hLSM 基因分別成功地被轉(zhuǎn)入 WI-38 細(xì)胞內(nèi)，并能在 WI-38 細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。圖 1-3 轉(zhuǎn)染 WI-38 細(xì)胞的 RT-PCR 鑒定

hOSM 基因在 WI-38 細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的鑒定組 WI38-pcDNA3.0-hLIF、WI38-pcDNA3.1(-)-hOSM 和空載 RNA 進(jìn)行 RT-PCR，其產(chǎn)物經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，兩實(shí)，而空載體對(duì)照組則沒(méi)有相應(yīng)的條帶（如圖 1-3）。上述結(jié)果表別成功地被轉(zhuǎn)入 WI-38 細(xì)胞內(nèi)，并能在 WI-38 細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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