目的應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選出與干擾素刺激因子（stimulator of IFN genes,STING）相作用的分子,為深入研究STING蛋白的分子水平的功能奠定基礎(chǔ)。方法利用基因克隆的方法構(gòu)建酵母雙雜交質(zhì)粒pGBKT7-STING。應(yīng)用酵母雜交技術(shù)從人胚腎cDNA庫中篩選出與STING蛋白相互作用的蛋白,并在酵母中從新驗證其相互作用。結(jié)果應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出與STING蛋白相作用的19個候選分子,成功構(gòu)建pGBKT7-STING質(zhì)粒,且可以在酵母中表達(dá)。結(jié)論應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)可篩選出與STING蛋白相互作用蛋白。 

【文章來源】：牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2019,40(03)

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

STING蛋白瓊脂糖凝膠電泳分析A:STING蛋白的PCＲ產(chǎn)物電泳圖;B:pGBKT7－STING雙酶切后電泳圖

?炕?⒎直鷯?KpnI和XhoI連接，并與相同的pGBKT7載體連接。篩選陽性克隆，通過KpnI和XhoI消化如圖1所示和DNA測序分析鑒定陽性克隆。Blast比對完全正確。圖1STING蛋白瓊脂糖凝膠電泳分析A:STING蛋白的PCＲ產(chǎn)物電泳圖;B:pGBKT7－STING雙酶切后電泳圖2．2誘導(dǎo)蛋白在酵母細(xì)胞中STING蛋白的表達(dá)將pGBKT7和pGBKT7－STING分別轉(zhuǎn)染到酵母細(xì)胞中。擴(kuò)增培養(yǎng)物，將細(xì)胞裂解提取酵母蛋白，利用免疫印跡檢測酵母細(xì)胞中STING蛋白的表達(dá)。結(jié)果如圖2所示，pGBKT7－STING在對應(yīng)位置出現(xiàn)條帶。圖2誘餌質(zhì)粒pGBKT7－STING在酵母中的表達(dá)2．3PCＲ陽性克隆將含有誘餌質(zhì)粒pGBKT7－STING的酵母與人胚腎cDNA庫融合在QDO/X/A皿上選擇藍(lán)色克隆進(jìn)行大量篩選。獲取酵母質(zhì)粒并使用酵母F－T7，Ｒ－3＇AD作為引物利用PCＲ鑒定。將具有陽性克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。獲得。一共挑取了242個克隆進(jìn)行PCＲ鑒定，其中19個是非重復(fù)且有意義的陽性克隆，如圖3所示。圖3PCＲ鑒定陽性克隆質(zhì)粒M:Marker;1－19:PCＲ產(chǎn)物2．4在酵母體內(nèi)監(jiān)測STING蛋白與候選分子的相互作用本實驗將pGBKT7－STING和pGBKT7－junB一起轉(zhuǎn)化到酵母Y2H感受態(tài)細(xì)胞，按不同濃度梯度涂于SD/－Trp－Leu－His－Ade/X－α－GAL/AbA平板，誘餌質(zhì)粒在不同培養(yǎng)基上的生長結(jié)果如圖4所示，出現(xiàn)藍(lán)色菌落。我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的菌落顏色深淺有差異，菌落大小也存在差異，這提示候選分子與酵母中的STING蛋白之間一定的作用關(guān)系。圖4酵母雙雜交篩選與STING蛋白在酵母中存在相?

??STING蛋白的表達(dá)。結(jié)果如圖2所示，pGBKT7－STING在對應(yīng)位置出現(xiàn)條帶。圖2誘餌質(zhì)粒pGBKT7－STING在酵母中的表達(dá)2．3PCＲ陽性克隆將含有誘餌質(zhì)粒pGBKT7－STING的酵母與人胚腎cDNA庫融合在QDO/X/A皿上選擇藍(lán)色克隆進(jìn)行大量篩選。獲取酵母質(zhì)粒并使用酵母F－T7，Ｒ－3＇AD作為引物利用PCＲ鑒定。將具有陽性克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。獲得。一共挑取了242個克隆進(jìn)行PCＲ鑒定，其中19個是非重復(fù)且有意義的陽性克隆，如圖3所示。圖3PCＲ鑒定陽性克隆質(zhì)粒M:Marker;1－19:PCＲ產(chǎn)物2．4在酵母體內(nèi)監(jiān)測STING蛋白與候選分子的相互作用本實驗將pGBKT7－STING和pGBKT7－junB一起轉(zhuǎn)化到酵母Y2H感受態(tài)細(xì)胞，按不同濃度梯度涂于SD/－Trp－Leu－His－Ade/X－α－GAL/AbA平板，誘餌質(zhì)粒在不同培養(yǎng)基上的生長結(jié)果如圖4所示，出現(xiàn)藍(lán)色菌落。我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的菌落顏色深淺有差異，菌落大小也存在差異，這提示候選分子與酵母中的STING蛋白之間一定的作用關(guān)系。圖4酵母雙雜交篩選與STING蛋白在酵母中存在相互作用的候選分子3討論為進(jìn)一步研究STING蛋白對先天免疫應(yīng)答過程的調(diào)節(jié)作用，本研究以STING為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交方法從人胚胎腎cDNA文庫中篩選出與STING蛋白相互作用的候選分子。為了尋找與STING蛋白有相互作用的候選分子，本研究首先設(shè)計特異性引物，構(gòu)建誘餌質(zhì)粒GBKT7－STING。再將重組質(zhì)粒GBKT7－STING轉(zhuǎn)化酵母Y2H感受態(tài)細(xì)胞，應(yīng)用此誘餌質(zhì)粒進(jìn)行酵母雙雜交，用來篩選與STING蛋白存在相互作用的候選分子。將誘餌質(zhì)粒GBKT7－S

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Innate recognition of microbial-derived signals in immunity and inflammation[J]. Yue Zhang,Chunli Liang.  Science China（Life Sciences）. 2016(12)



本文編號：3577082