腦膜炎球菌fHBP的克隆表達(dá)與免疫原性研究
發(fā)布時(shí)間：2022-01-06 19:18
目的選用pET蛋白表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)A、B兩個(gè)亞家族的fHBP蛋白（fHBP-A和fHBP-B）,制備腦膜炎球菌蛋白疫苗,并對其進(jìn)行免疫原性檢測,評價(jià)該蛋白疫苗抵抗腦膜炎球菌感染的保護(hù)作用。方法以腦膜炎球菌Nm048（A家族）與Nm035（B家族）菌株裂解液為模版擴(kuò)增目的基因fHBP-A與fHBP-B,與原核表達(dá)載體pET-24b連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-24b-fHBP-A和pET-24b-fHBP-B。分別用pET-24b-fHBP-A和pET-24b-fHBP-B轉(zhuǎn)化大腸埃希菌,通過Western blot檢測目的蛋白表達(dá)情況并用Ni2+柱層析和凝膠過濾層析進(jìn)行純化。將家兔隨機(jī)分為4組,fHBP-A實(shí)驗(yàn)組、fHBP-B實(shí)驗(yàn)組、fHBP-A+fHBP-B實(shí)驗(yàn)組用相應(yīng)重組蛋白免疫,對照組注射PBS。采用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry,FCM）檢測免疫家兔抗血清與靶菌的結(jié)合情況,通過血清殺菌力試驗(yàn)（serum bactericidal assay,SBA）評價(jià)該疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果。結(jié)果 PCR擴(kuò)增出約760 bp的目的基因片段,經(jīng)雙酶切和測序鑒定重組質(zhì)...
【文章來源】：中國病原生物學(xué)雜志. 2019,14(02)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：5 頁
【部分圖文】：
圖１重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）１ＴｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＭＤＮＡ標(biāo)志物（ＤＬ２０００）
破菌，取上清，進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳，結(jié)果見圖２。表達(dá)蛋白的相對分子質(zhì)量約為３７×１０３，與重組ｆＨＢＰ－Ａ和ｆＨＢＰ－Ｂ蛋白的相對分子質(zhì)量理論值相符。Ｍ蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)１重組ｆＨＢＰ－Ａ蛋白２重組ｆＨ－ＢＰ－Ｂ蛋白圖２重組ｆＨＢＰ－Ａ和ｆＨＢＰ－Ｂ蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１ｆＨＢＰ－Ａ２ｆＨＢＰ－ＢＦｉｇ．２ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｆＨＢＰ－ＡａｎｄｆＨＢＰ－Ｂｐｒｏｔｅｉｎ３表達(dá)產(chǎn)物的純化及鑒定取重組菌超聲破碎后上清進(jìn)行Ｎｉ２＋柱親和層析和凝膠過濾層析純化，純化后的重組蛋白經(jīng)凝膠圖像系統(tǒng)處理分析，純度均＞９５％，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測純化的重組蛋白均可與抗Ｈｉｓ－ｔａｇ單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合（圖３）。Ｍ蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)１純化的重組ｆＨＢＰ－Ａ蛋白與相應(yīng)抗體的反應(yīng)條帶２純化的重組ｆＨＢＰ－Ｂ蛋白與相應(yīng)抗體的反應(yīng)條帶圖３純化的重組蛋白產(chǎn)物的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１ｆＨＢＰ－Ａ２ｆＨＢＰ－ＢＦｉｇ．３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ４免疫家兔特異ＩｇＧ抗體滴度采用ＥＬＩＳＡ檢測實(shí)驗(yàn)家兔末次免疫后７～１０ｄ血清特異ＩｇＧ抗體滴度ｆＨＢＰ－Ａ、ｆＨＢＰ－Ｂ、ｆＨＢＰ－Ａ＋ｆＨＢＰ－Ｂ免疫組１／ＧＭＴ分別為１．８×１０４、４．９×１０５、４．８×１０５。５抗體與Ｎｍ菌的結(jié)合反應(yīng)流式細(xì)胞
４．９×１０５、４．８×１０５。５抗體與Ｎｍ菌的結(jié)合反應(yīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測２個(gè)重組蛋白與分別表達(dá)Ａ，Ｂ兩個(gè)亞家族ｆＨＢＰ蛋白的Ｎｍ０４８與Ｎｍ０３５的結(jié)合反應(yīng)，以Ｎｍ２９０１９、Ｎｍ２９０２２全菌體免疫所得兔血清為陽性對照，結(jié)果見圖５。各抗血清均能與Ｎｍ０３５和Ｎｍ０４８均發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，ｆＨＢＰ－Ａ＋ｆＨＢＰ－Ｂ免疫家兔抗血清與靶菌的結(jié)合具有交叉反應(yīng)性，而單一組分重組蛋白抗血清則表現(xiàn)出一定的家族特異性。圖４ＥＬＩＳＡ測定重組蛋白免疫家兔血清特異ＩｇＧ抗體滴度（１／ＧＭＴ）Ｆｉｇ．４ＥＬＩＳＡｔｉｔｅｒｓ（１／ＧＭＴ）ｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔｆＨＢＰ－ＡａｎｄｆＨＢＰ－Ｂ注（Ｎｏｔｅ）：Ｐ為陽性對照（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ）。圖５流式細(xì)胞術(shù)檢測抗重組蛋白抗體與菌體的結(jié)合反應(yīng)Ｆｉｇ．５Ｂｉｎｄｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｂａｃｔｅｒｉａｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ６抗血清殺菌力檢測利用Ｎｍ０３５與Ｎｍ０４８兩個(gè)菌株對各組抗血清進(jìn)行保護(hù)作用評估，結(jié)果見圖６。ｆＨＢＰ－Ａ抗血清和ｆＨＢＰ－Ｂ抗血清分別對Ｎｍ０４８與Ｎｍ０３５具有一定的殺菌作用，ｆＨＢＰ－Ａ＋ｆＨＢＰ－Ｂ抗血清對兩菌株均具有殺菌作用。圖６重組蛋白抗血清殺菌力檢測Ｆｉｇ．６Ｔｈｅｓｅｒｕｍｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌａｃｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔ討論本研究構(gòu)建了ｐＥＴ－２４ｂ－ｆＨＢＰ－Ａ與ｐＥＴ－２４ｂ－ｆＨ－ＢＰ－Ｂ２
本文編號(hào)：3573024
【文章來源】：中國病原生物學(xué)雜志. 2019,14(02)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：5 頁
【部分圖文】：
圖１重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定ＭＤＮＡｍａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）１ＴｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＭＤＮＡ標(biāo)志物（ＤＬ２０００）
破菌，取上清，進(jìn)行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳，結(jié)果見圖２。表達(dá)蛋白的相對分子質(zhì)量約為３７×１０３，與重組ｆＨＢＰ－Ａ和ｆＨＢＰ－Ｂ蛋白的相對分子質(zhì)量理論值相符。Ｍ蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)１重組ｆＨＢＰ－Ａ蛋白２重組ｆＨ－ＢＰ－Ｂ蛋白圖２重組ｆＨＢＰ－Ａ和ｆＨＢＰ－Ｂ蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１ｆＨＢＰ－Ａ２ｆＨＢＰ－ＢＦｉｇ．２ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｆＨＢＰ－ＡａｎｄｆＨＢＰ－Ｂｐｒｏｔｅｉｎ３表達(dá)產(chǎn)物的純化及鑒定取重組菌超聲破碎后上清進(jìn)行Ｎｉ２＋柱親和層析和凝膠過濾層析純化，純化后的重組蛋白經(jīng)凝膠圖像系統(tǒng)處理分析，純度均＞９５％，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ檢測純化的重組蛋白均可與抗Ｈｉｓ－ｔａｇ單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合（圖３）。Ｍ蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)１純化的重組ｆＨＢＰ－Ａ蛋白與相應(yīng)抗體的反應(yīng)條帶２純化的重組ｆＨＢＰ－Ｂ蛋白與相應(yīng)抗體的反應(yīng)條帶圖３純化的重組蛋白產(chǎn)物的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１ｆＨＢＰ－Ａ２ｆＨＢＰ－ＢＦｉｇ．３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ４免疫家兔特異ＩｇＧ抗體滴度采用ＥＬＩＳＡ檢測實(shí)驗(yàn)家兔末次免疫后７～１０ｄ血清特異ＩｇＧ抗體滴度ｆＨＢＰ－Ａ、ｆＨＢＰ－Ｂ、ｆＨＢＰ－Ａ＋ｆＨＢＰ－Ｂ免疫組１／ＧＭＴ分別為１．８×１０４、４．９×１０５、４．８×１０５。５抗體與Ｎｍ菌的結(jié)合反應(yīng)流式細(xì)胞
４．９×１０５、４．８×１０５。５抗體與Ｎｍ菌的結(jié)合反應(yīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測２個(gè)重組蛋白與分別表達(dá)Ａ，Ｂ兩個(gè)亞家族ｆＨＢＰ蛋白的Ｎｍ０４８與Ｎｍ０３５的結(jié)合反應(yīng)，以Ｎｍ２９０１９、Ｎｍ２９０２２全菌體免疫所得兔血清為陽性對照，結(jié)果見圖５。各抗血清均能與Ｎｍ０３５和Ｎｍ０４８均發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，ｆＨＢＰ－Ａ＋ｆＨＢＰ－Ｂ免疫家兔抗血清與靶菌的結(jié)合具有交叉反應(yīng)性，而單一組分重組蛋白抗血清則表現(xiàn)出一定的家族特異性。圖４ＥＬＩＳＡ測定重組蛋白免疫家兔血清特異ＩｇＧ抗體滴度（１／ＧＭＴ）Ｆｉｇ．４ＥＬＩＳＡｔｉｔｅｒｓ（１／ＧＭＴ）ｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔｆＨＢＰ－ＡａｎｄｆＨＢＰ－Ｂ注（Ｎｏｔｅ）：Ｐ為陽性對照（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ）。圖５流式細(xì)胞術(shù)檢測抗重組蛋白抗體與菌體的結(jié)合反應(yīng)Ｆｉｇ．５Ｂｉｎｄｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｂａｃｔｅｒｉａｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ６抗血清殺菌力檢測利用Ｎｍ０３５與Ｎｍ０４８兩個(gè)菌株對各組抗血清進(jìn)行保護(hù)作用評估，結(jié)果見圖６。ｆＨＢＰ－Ａ抗血清和ｆＨＢＰ－Ｂ抗血清分別對Ｎｍ０４８與Ｎｍ０３５具有一定的殺菌作用，ｆＨＢＰ－Ａ＋ｆＨＢＰ－Ｂ抗血清對兩菌株均具有殺菌作用。圖６重組蛋白抗血清殺菌力檢測Ｆｉｇ．６Ｔｈｅｓｅｒｕｍｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌａｃｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔ討論本研究構(gòu)建了ｐＥＴ－２４ｂ－ｆＨＢＰ－Ａ與ｐＥＴ－２４ｂ－ｆＨ－ＢＰ－Ｂ２
本文編號(hào)：3573024
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