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TIGAR通過磷酸戊糖旁路和Cdk5-ATM通路調(diào)節(jié)DNA的損傷與修復(fù)的研究

發(fā)布時(shí)間:2017-05-10 11:11

  本文關(guān)鍵詞:TIGAR通過磷酸戊糖旁路和Cdk5-ATM通路調(diào)節(jié)DNA的損傷與修復(fù)的研究,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。


【摘要】:目的:探討TIGAR基因在乏氧誘導(dǎo)下的DNA損傷應(yīng)答中發(fā)揮的作用,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。方法:在Hep G2細(xì)胞中用si RNA抑制TIGAR基因的表達(dá);瘜W(xué)乏氧劑Co Cl2用于敲除TIGAR過后的Hep G2細(xì)胞。用彗星實(shí)驗(yàn)來測(cè)算各組細(xì)胞DNA的損傷程度,用免疫熒光法來檢測(cè)γ-H2AX的表達(dá)情況,Brdu參入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA合成情況。Western blot檢測(cè)干擾TIGAR基因表達(dá)48 h后G6PD蛋白表達(dá)情況并檢測(cè)其干擾效率。NADPH、核糖和ROS的清除劑NAC分別被用于實(shí)驗(yàn)各組,用彗星實(shí)驗(yàn)來測(cè)算各組細(xì)胞DNA的損傷程度。免疫熒光檢測(cè)經(jīng)Co Cl2處理后TIGAR蛋白的分布。通過核質(zhì)分離技術(shù)提取各組分蛋白后,經(jīng)Western blot檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)Co Cl處理后TIGAR是否發(fā)生核轉(zhuǎn)位。為探究TIGAR在DDR中所擔(dān)任的角色,si RNA抑制TIGAR,或用ATM及Ckd5特異性抑制劑KU55933及roscovotine分別處理經(jīng)Co Cl2處理后的Hep G2細(xì)胞,Western blot檢測(cè)TIGAR、ATM、p-ATM和ckd5的表達(dá)水平,用彗星試驗(yàn)來測(cè)算各組細(xì)胞DNA的損傷程度。結(jié)果:用Co Cl2(200μM)處理10 h后,與對(duì)照組相比引起少量DNA損傷。敲除TIGAR后,從彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出彗星尾部DNA所占百分比和尾部長(zhǎng)度明顯增加,表明在敲除TIGAR基礎(chǔ)上應(yīng)用相同計(jì)量時(shí)間的Co Cl2處理細(xì)胞的DNA損傷明顯增加。在敲除TIGAR的Hep G2細(xì)胞中,Co Cl2能明顯上調(diào)細(xì)胞核中γ-H2AX的表達(dá)水平。同時(shí),Brdu參入實(shí)驗(yàn)顯示,敲除TIGAR減少了DNA的合成。Western blot結(jié)果顯示,G6PD的表達(dá)伴隨TIGAR的敲除而降低。彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲除TIGAR所導(dǎo)致的Co Cl2或表阿霉素誘導(dǎo)的DNA損傷增加可以被NADPH、核糖或NAC所部分逆轉(zhuǎn)。免疫熒光和通過核質(zhì)分離技術(shù)提取核蛋白后,經(jīng)Western blot檢測(cè)TIGAR蛋白的分布表明,在用Co Cl2(200μM)處理8h和12h后TIGAR入核明顯增加。經(jīng)Western blot檢測(cè),TIGAR和p-ATM的上調(diào)有時(shí)間相關(guān)性,而應(yīng)用ATM特異性抑制劑KU55933處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)KU55933并未影響TIGAR的表達(dá)。彗星實(shí)驗(yàn)顯示,經(jīng)KU55933處理過后,由Co Cl2所引起的DNA損傷明顯增加。Western blot結(jié)果顯示,Hep G2細(xì)胞經(jīng)Co Cl2處理后Cdk5的表達(dá)明顯上調(diào),而且這種上調(diào)可以因TIGAR的敲除而被明顯抑制。Ckd5抑制劑roscovotine處理后,Western blot顯示roscovotine明顯抑制了Co Cl2引起的p-ATM的上調(diào),彗星實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示,roscovotine明顯增加了Co Cl2誘導(dǎo)的DNA損傷。以上各實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:敲除TIGAR后增加了DNA損傷的程度,并且這種效應(yīng)可以被PPP旁路產(chǎn)物NADPH、核糖核酸和ROS清除劑NAC所部分消除。腫瘤細(xì)胞被表阿霉素和乏氧刺激后,TIGAR被誘導(dǎo)并重新定位于細(xì)胞核。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),TIGAR通過調(diào)節(jié)Cdk 5從而調(diào)節(jié)DDR(DNA損傷應(yīng)答)中的關(guān)鍵蛋白—ATM的磷酸化反應(yīng)。Cdk5-AMT信號(hào)調(diào)節(jié)通路通過TIGAR引入到DDR反應(yīng)的調(diào)節(jié)過程中。這賦予了TIAGR一個(gè)在腫瘤細(xì)胞生存方面的一個(gè)新的功能,這預(yù)示著TIGAR可以成為腫瘤化療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】:TIGAR DDR PPP Cdk5 ATM
【學(xué)位授予單位】:蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2015
【分類號(hào)】:R3416
【目錄】:
  • 摘要4-6
  • Abstract6-9
  • 研究背景9-11
  • 第一部分 TIGAR 基因調(diào)節(jié) PPP 通路對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA 損傷修復(fù)的影響11-26
  • 第一節(jié) TIGAR對(duì)DNA損傷的影響11-21
  • 材料與方法11-18
  • 實(shí)驗(yàn)結(jié)果18-20
  • 小結(jié)20-21
  • 第二節(jié) PPP通路對(duì)DNA損傷修復(fù)的影響21-26
  • 材料和方法21-24
  • 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-25
  • 小結(jié)25-26
  • 第二部分 TIGAR基因的核轉(zhuǎn)位及其對(duì)Cdk5-ATM通路的調(diào)節(jié)26-35
  • 第一節(jié) 乏氧對(duì)TIGAR定位的影響26-30
  • 材料與方法26-28
  • 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-29
  • 小結(jié)29-30
  • 第二節(jié) TIGAR基因通過調(diào)節(jié)Cdk5-ATM通路影響DNA損傷修復(fù)30-35
  • 材料和方法30-31
  • 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-34
  • 小結(jié)34-35
  • 討論35-39
  • 全文結(jié)論39-40
  • 參考文獻(xiàn)40-43
  • 綜述43-52
  • 參考文獻(xiàn)49-52
  • 縮略詞表52-53
  • 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文53-54
  • 致謝54-56

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本文編號(hào):354616

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