強啡肽對脊髓cNOS與iNOS活性、分布和基因表達的影響及機制
發(fā)布時間：2021-12-19 08:34
強啡肽A1-17(DynorphinA1-17，Dyn)是內(nèi)源性κ受體激動劑，蛛網(wǎng)膜下腔注射（Intrathecal Injection，i．t．）后產(chǎn)生強烈的鎮(zhèn)痛作用，但大劑量時常伴一過性或持久性雙下肢和尾部癱瘓。在外周神經(jīng)病痛和脊髓損傷（Spinal Cord Injury，SCI）后內(nèi)源性Dyn含量和基因表達均明顯升高，提示Dyn與鎮(zhèn)痛或痛調(diào)制及脊髓繼發(fā)損傷機制有關。但Dyn致SCI與鎮(zhèn)痛作用的機制尚不清楚。一氧化氮（Nitric Oxide，NO）和c-fos具有廣泛而復雜的生理與病理作用，近幾年受到普遍關注。為了闡明cNOS和iNOS在Dyn致SCI（腹角）和鎮(zhèn)痛（背角）中的不同作用及其與NMDA受體、Ca2+和c-fos間的相互關系，為SCI、阿片肽和NO的理論研究及臨床應用提供依據(jù)，本論文采用組化、免疫組化和原位雜交技術觀測Dyn致SCI和鎮(zhèn)痛過程中NADPH-d活性、bcNOS與iNOS及c-fos免疫活性（IR）和mRNA表達的改變，采用3H-L-Arg轉(zhuǎn)化和...
【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學院北京市 211工程院校 985工程院校
【文章頁數(shù)】：149 頁
【學位級別】：博士
【文章目錄】：
1 英文縮略詞
2 中文摘要
3 英文摘要
4 前言
5 材料與方法
5.1 藥品與試劑
5.2 動物、手術和藥物引入
5.3 后肢運動功能測定
5.4 痛敏行為觀察
5.5 熱輻射甩尾潛伏期(TFL)和縮腿潛伏期(FFL)測定
5.6 大鼠Formalin致痛模型
5.7 脊髓原代細胞培養(yǎng)
5.7.1 孕鼠胎齡判定
5.7.2 鼠尾膠原制備
5.7.3 鼠尾膠原和多聚賴氨酸雙層鋪板
5.7.4 培養(yǎng)方法
5.8 培養(yǎng)神經(jīng)細胞的損傷程度判定
5.8.1 形態(tài)觀察
5.8.2 LDH測定
5.8.3 細胞死亡率
5.8.4 NO測定(Griess法)
5.9 顯微熒光光度技術測定脊髓神經(jīng)元單細胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca~(2+)]i)
5.10 cNOS和iNOS活性測定
5.10.1 取材與凍存
5.10.2 ~3H-L-Arg轉(zhuǎn)化實驗
5.11 脊髓膜制備與~3H-MK801結(jié)合實驗
5.12 神經(jīng)形態(tài)學研究方法
5.12.1 灌注固定、取材與切片
5.12.2 尼氏體染色
5.12.3 NADPH-d組化染色
5.12.4 免疫組織(細胞)化學ABC反應法
5.13 分子生物學方法
5.13.1 bcNOS、iNOS和c-fos質(zhì)粒cDNA的擴增和提取
5.13.1.1 感受態(tài)細胞的制備
5.13.1.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、克隆與擴增
5.13.1.3 質(zhì)粒DNA小量提取
5.13.1.4 質(zhì)粒DNA中量提取與純化
5.13.1.5 酶切鑒定
5.13.2 bcNOS、iNOS和c-fos探針制備與特異性鑒定
5.13.2.1 bcNOS、iNOS和c-fos相互獨立(特異)的探針選擇
5.13.2.2 探針的回收
5.13.3 探針標記與檢測
5.13.4 斑點雜交
5.13.5 原位雜交
5.13.5.1 主要溶液配制
5.13.5.2 漂浮法原位雜交基本程序
5.13.5.3 實驗對照與條件控制
5.14 半定量分析
5.15 統(tǒng)計學方法
6 結(jié)果
6.1 Dyn致癱后cNOS和iNOS活性與mRNA表達。
6.1.1 不同劑量Dyn對大鼠脊髓功能和病理的影響。
6.1.2 Dyn致癱后不同時間背側(cè)與腹側(cè)脊髓cNOS和iNOS活性變化。
6.1.3 Dyn致癱后NADPH-d變化
6.1.4 Dyn致癱后bcNOS和iNOS免疫活性變化
6.1.5 bcNOS-IR與NADPH-d活性變化的比較
6.1.6 致癱劑量Dyn對bcNOS和iNOS mRNA表達的影響
6.1.6.1 方法鑒定
6.1.6.2 bcNOSmRNA表達的細胞定位與損傷反應
6.1.6.3 iNOSmRNA表達的細胞定位和損傷反應
6.1.7 小結(jié)
6.2 NOS抑制劑L-NAME,7-NI和AG對Dyn致癱和鎮(zhèn)痛作用的影響
6.2.1 功能對抗與病理改善
6.2.1.1 對ecNOS和bcNOS無選擇性的cNOS抑制劑L-NAME
6.2.1.2 iNOS選擇性抑制劑AG
6.2.1.3 bcNOS選擇性抑制7-NI
6.2.2 背側(cè)與腹側(cè)脊髓cNOS和iNOS活性變化
6.2.3 NADPH-d活性與bcNOS免疫活性變化
6.2.4 小結(jié)
6.3 NOS底物L-Arg和NO供體Sper／NO對Dyn致癱和鎮(zhèn)痛作用的影響
6.3.1 功能與病理變化
6.3.1.1 L-Arg低劑量鎮(zhèn)痛和高劑量致痛
6.3.1.2 Sper／NO低劑量對抗Dyn致癱和加強鎮(zhèn)痛,高劑量本身致癱和致痛
6.3.2 背側(cè)與腹側(cè)脊髓cNOS和iNOS活性和MK801結(jié)合的變化
6.3.3 小結(jié)
6.4 Dyn致癱和鎮(zhèn)痛時NOS表達與NMDA和_κ受體的相互關系)
6.4.1 Dyn致癱和鎮(zhèn)痛時NMDA受體活性與NOS表達的相互關系
6.4.2 _κ受體參與Dyn致癱引起的NOS表達增強
6.4.3 小結(jié)
6.5 Dyn致癱和鎮(zhèn)痛時NOS與c-fos表達的相互關系
6.5.1 c-Fos免疫組化的最佳條件與正常分布
6.5.2 Dyn致癱早期c-Fos-IR表達明顯落后于bcNOS-IR,但后期c-Fos-IR和bcNOS-IR均持續(xù)性表達,并與病理損害和功能障礙密切相關。
6.5.3 鎮(zhèn)痛劑量Dyn可明顯抑制Formalin誘發(fā)的c-Fos-IR和bcNOS-IR表達,并被Nor-BNI所對抗
6.5.4 鎮(zhèn)痛劑量Dyn可明顯抑制Formalin誘發(fā)的c-fos、bcNOS和iNOSmRNA表達,并被Nor-BNI對抗
6.5.5 NOS與c-fos之間的跨細胞信息傳遞
6.5.6.小結(jié)
6.6 Dyn通過_κ和NMDA受體影響單細胞內(nèi)游離Ca~(2+)濃度
6.6.1 Dyn對去極化性[Ca2+]i的抑制和促進作用
6.6.2 NMDA和_κ受體機制
6.6.3 小結(jié)
6.7 離體培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元的NMDA和Dyn毒性
6.7.1 離體培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元NMDA的毒性和NO介導機制
6.7.2 DynA(1-17)對培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元的影響
6.7.3 小結(jié)
7 討論
7.1 腹側(cè)和背側(cè)脊髓NOS變化與Dyn致癱和鎮(zhèn)痛作用
7.2 bcNOS與iNOS在Dyn致脊髓損傷中的不同作用
7.3 Dyn致脊髓損傷后bcNOS和iNOS的細胞來源
7.4 bcNOS和iNOS引起神經(jīng)損傷的機制
7.5 Dyn誘發(fā)腹側(cè)脊髓bcNOS和iNOS高表達的機制
7.6 NMDA-NOS／NO與Dyn鎮(zhèn)痛(痛調(diào)制)
7.7 NO的血管作用與細胞作用
7.8 Dyn致癱的缺血機制與細胞毒性機制
7.9 脊髓表達多種基因的共性分析與意義
7.10 Dyn致脊髓損傷后iNOSmRNA表達而iNOS-IR陰性的原因分析
7.11 bcNOS神經(jīng)元的自身保護與自身滅亡
8 結(jié)論
9 致謝
10 參考文獻
11 綜述一：NO在神經(jīng)損傷中的保護與毒性作用
11.1 NO簡況
11.2 NO的神經(jīng)毒性與保護作用
11.3 NO的神經(jīng)保護機制
11.4 NO的神經(jīng)毒性機制
11.5 參考文獻
12 綜述二：強啡肽痛調(diào)制和致神經(jīng)損傷作用的研究進展
12.1 Dyn鎮(zhèn)痛與致痛作用及其機制
12.2 Dyn致神經(jīng)損傷作用及其機制
12.3 參考文獻
13 攻讀博士學位期間發(fā)表的論文
14 個人簡歷
15 導師組成員
本文編號：3544103
【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學院北京市 211工程院校 985工程院校
【文章頁數(shù)】：149 頁
【學位級別】：博士
【文章目錄】：
1 英文縮略詞
2 中文摘要
3 英文摘要
4 前言
5 材料與方法
5.1 藥品與試劑
5.2 動物、手術和藥物引入
5.3 后肢運動功能測定
5.4 痛敏行為觀察
5.5 熱輻射甩尾潛伏期(TFL)和縮腿潛伏期(FFL)測定
5.6 大鼠Formalin致痛模型
5.7 脊髓原代細胞培養(yǎng)
5.7.1 孕鼠胎齡判定
5.7.2 鼠尾膠原制備
5.7.3 鼠尾膠原和多聚賴氨酸雙層鋪板
5.7.4 培養(yǎng)方法
5.8 培養(yǎng)神經(jīng)細胞的損傷程度判定
5.8.1 形態(tài)觀察
5.8.2 LDH測定
5.8.3 細胞死亡率
5.8.4 NO測定(Griess法)
5.9 顯微熒光光度技術測定脊髓神經(jīng)元單細胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca~(2+)]i)
5.10 cNOS和iNOS活性測定
5.10.1 取材與凍存
5.10.2 ~3H-L-Arg轉(zhuǎn)化實驗
5.11 脊髓膜制備與~3H-MK801結(jié)合實驗
5.12 神經(jīng)形態(tài)學研究方法
5.12.1 灌注固定、取材與切片
5.12.2 尼氏體染色
5.12.3 NADPH-d組化染色
5.12.4 免疫組織(細胞)化學ABC反應法
5.13 分子生物學方法
5.13.1 bcNOS、iNOS和c-fos質(zhì)粒cDNA的擴增和提取
5.13.1.1 感受態(tài)細胞的制備
5.13.1.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、克隆與擴增
5.13.1.3 質(zhì)粒DNA小量提取
5.13.1.4 質(zhì)粒DNA中量提取與純化
5.13.1.5 酶切鑒定
5.13.2 bcNOS、iNOS和c-fos探針制備與特異性鑒定
5.13.2.1 bcNOS、iNOS和c-fos相互獨立(特異)的探針選擇
5.13.2.2 探針的回收
5.13.3 探針標記與檢測
5.13.4 斑點雜交
5.13.5 原位雜交
5.13.5.1 主要溶液配制
5.13.5.2 漂浮法原位雜交基本程序
5.13.5.3 實驗對照與條件控制
5.14 半定量分析
5.15 統(tǒng)計學方法
6 結(jié)果
6.1 Dyn致癱后cNOS和iNOS活性與mRNA表達。
6.1.1 不同劑量Dyn對大鼠脊髓功能和病理的影響。
6.1.2 Dyn致癱后不同時間背側(cè)與腹側(cè)脊髓cNOS和iNOS活性變化。
6.1.3 Dyn致癱后NADPH-d變化
6.1.4 Dyn致癱后bcNOS和iNOS免疫活性變化
6.1.5 bcNOS-IR與NADPH-d活性變化的比較
6.1.6 致癱劑量Dyn對bcNOS和iNOS mRNA表達的影響
6.1.6.1 方法鑒定
6.1.6.2 bcNOSmRNA表達的細胞定位與損傷反應
6.1.6.3 iNOSmRNA表達的細胞定位和損傷反應
6.1.7 小結(jié)
6.2 NOS抑制劑L-NAME,7-NI和AG對Dyn致癱和鎮(zhèn)痛作用的影響
6.2.1 功能對抗與病理改善
6.2.1.1 對ecNOS和bcNOS無選擇性的cNOS抑制劑L-NAME
6.2.1.2 iNOS選擇性抑制劑AG
6.2.1.3 bcNOS選擇性抑制7-NI
6.2.2 背側(cè)與腹側(cè)脊髓cNOS和iNOS活性變化
6.2.3 NADPH-d活性與bcNOS免疫活性變化
6.2.4 小結(jié)
6.3 NOS底物L-Arg和NO供體Sper／NO對Dyn致癱和鎮(zhèn)痛作用的影響
6.3.1 功能與病理變化
6.3.1.1 L-Arg低劑量鎮(zhèn)痛和高劑量致痛
6.3.1.2 Sper／NO低劑量對抗Dyn致癱和加強鎮(zhèn)痛,高劑量本身致癱和致痛
6.3.2 背側(cè)與腹側(cè)脊髓cNOS和iNOS活性和MK801結(jié)合的變化
6.3.3 小結(jié)
6.4 Dyn致癱和鎮(zhèn)痛時NOS表達與NMDA和_κ受體的相互關系)
6.4.1 Dyn致癱和鎮(zhèn)痛時NMDA受體活性與NOS表達的相互關系
6.4.2 _κ受體參與Dyn致癱引起的NOS表達增強
6.4.3 小結(jié)
6.5 Dyn致癱和鎮(zhèn)痛時NOS與c-fos表達的相互關系
6.5.1 c-Fos免疫組化的最佳條件與正常分布
6.5.2 Dyn致癱早期c-Fos-IR表達明顯落后于bcNOS-IR,但后期c-Fos-IR和bcNOS-IR均持續(xù)性表達,并與病理損害和功能障礙密切相關。
6.5.3 鎮(zhèn)痛劑量Dyn可明顯抑制Formalin誘發(fā)的c-Fos-IR和bcNOS-IR表達,并被Nor-BNI所對抗
6.5.4 鎮(zhèn)痛劑量Dyn可明顯抑制Formalin誘發(fā)的c-fos、bcNOS和iNOSmRNA表達,并被Nor-BNI對抗
6.5.5 NOS與c-fos之間的跨細胞信息傳遞
6.5.6.小結(jié)
6.6 Dyn通過_κ和NMDA受體影響單細胞內(nèi)游離Ca~(2+)濃度
6.6.1 Dyn對去極化性[Ca2+]i的抑制和促進作用
6.6.2 NMDA和_κ受體機制
6.6.3 小結(jié)
6.7 離體培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元的NMDA和Dyn毒性
6.7.1 離體培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元NMDA的毒性和NO介導機制
6.7.2 DynA(1-17)對培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元的影響
6.7.3 小結(jié)
7 討論
7.1 腹側(cè)和背側(cè)脊髓NOS變化與Dyn致癱和鎮(zhèn)痛作用
7.2 bcNOS與iNOS在Dyn致脊髓損傷中的不同作用
7.3 Dyn致脊髓損傷后bcNOS和iNOS的細胞來源
7.4 bcNOS和iNOS引起神經(jīng)損傷的機制
7.5 Dyn誘發(fā)腹側(cè)脊髓bcNOS和iNOS高表達的機制
7.6 NMDA-NOS／NO與Dyn鎮(zhèn)痛(痛調(diào)制)
7.7 NO的血管作用與細胞作用
7.8 Dyn致癱的缺血機制與細胞毒性機制
7.9 脊髓表達多種基因的共性分析與意義
7.10 Dyn致脊髓損傷后iNOSmRNA表達而iNOS-IR陰性的原因分析
7.11 bcNOS神經(jīng)元的自身保護與自身滅亡
8 結(jié)論
9 致謝
10 參考文獻
11 綜述一：NO在神經(jīng)損傷中的保護與毒性作用
11.1 NO簡況
11.2 NO的神經(jīng)毒性與保護作用
11.3 NO的神經(jīng)保護機制
11.4 NO的神經(jīng)毒性機制
11.5 參考文獻
12 綜述二：強啡肽痛調(diào)制和致神經(jīng)損傷作用的研究進展
12.1 Dyn鎮(zhèn)痛與致痛作用及其機制
12.2 Dyn致神經(jīng)損傷作用及其機制
12.3 參考文獻
13 攻讀博士學位期間發(fā)表的論文
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本文編號：3544103
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