目前，全世界有 3.5～4 億人為慢性乙肝病毒攜帶者，其中九千萬人發(fā)展成繼發(fā)性肝病。我國是 HBV 感染的高發(fā)區(qū)，約 1.7 億人受 HBV 感染，一千七百萬人患慢性肝炎。每年死于 HBV 導(dǎo)致的肝癌，肝硬化者約五十萬人。 接種乙肝疫苗是預(yù)防治乙肝病毒傳播的重要手段。目前，生產(chǎn)乙肝疫苗有酵母和 CHO 細(xì)胞兩種表達(dá)系統(tǒng)，其中利用 CHO 細(xì)胞表達(dá)的 HBsAg 作為疫苗具有免疫原性強(qiáng)，陽轉(zhuǎn)率高的優(yōu)點(diǎn)，但產(chǎn)量低是目前遇到的主要問題。 本項(xiàng)工作的目的是構(gòu)建高效表達(dá) HBsAg 的重組 CHO 工程細(xì)胞。首先，我們對 S 基因進(jìn)行了改造。我們提取目前生產(chǎn)使用的工程細(xì)胞 C28 的基因組，并根據(jù) S 基因兩端 DNA 序列設(shè)計(jì)一組引物 S 正和 S 反擴(kuò)增 S 基因片段。我們采用重疊 PCR 技術(shù)將 S 基因中 213，216，224 位三個稀有密碼子替換成哺乳動物細(xì)胞偏愛的密碼子，即 213TTA→ CTG； 216 TTA→ CTG； 224 GTA→GTG。得到 Sm。測序結(jié)果表明我們突變獲得成功。 其次，我們構(gòu)建了兩個表達(dá)載體 P1 和 P4，在構(gòu)建或選擇 CHO 細(xì)... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

利用重疊PCR突變S基因Fig.3.2theSgenemutationbyoverlappingPCR

組 PCR 反 2μL組 PCR 產(chǎn)物 2μLaq 0.5μL 32.5μLl 50μL于以下條件進(jìn)行 5 個循環(huán)：95 ℃ 30s，33℃ 系中加入 S 正 1 和 S 反 1 引物各 2μL，電泳回收 PCR 產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物與 T JM109 感受態(tài)細(xì)胞。挑選轉(zhuǎn)化子，送上和鑒定方法 pCI-neo 表達(dá)載體（見圖 3.3）的基礎(chǔ)上是經(jīng)改造的 Sm基因，DHFR 基因的順式基因的表達(dá)。構(gòu)建模式圖見圖 3.4。

P1載體的構(gòu)建圖

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3523416