應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)制備阿爾茨海默病小鼠模型
發(fā)布時間：2021-11-11 21:18
目的敲除α7煙堿型膽堿能受體（α7nAChR）基因構(gòu)建阿爾茨海默�。ˋD）小鼠模型,驗證成年敲除（KO）鼠是否有AD表征。方法利用CRISPR/Cas9技術(shù),針對α7nAChR基因靶序列設(shè)計單鏈向?qū)NA（sgRNA）,將sgRNA和Cas9 mRNA顯微注射到C57BL/6J小鼠受精卵。通過檢測DNA序列,鑒定和篩選出KO小鼠進行行為學(xué)測試。結(jié)果 KO鼠α7nAChR基因有531 bp片段敲除;與野生型（WT）組相比,KO組有高架十字迷宮開壁區(qū)活動時間短、條件性恐懼表現(xiàn)出僵直時間百分比增高的趨勢,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論成功制備AD模型鼠,成年KO鼠學(xué)習(xí)記憶功能正常,但有焦慮樣行為趨勢。
【文章來源】：中國老年學(xué)雜志. 2019,39(11)北大核心
【文章頁數(shù)】：4 頁
【部分圖文】：
sgＲNA序列設(shè)計示意圖
潭仍降?。水迷宮試驗包括定向航行實驗及空間探索實驗。條件性恐懼反射系統(tǒng)是基于巴普洛夫條件反射而建立的一種經(jīng)典的誘導(dǎo)焦慮反應(yīng)模型的方法。動物在恐懼時會表現(xiàn)出特有的僵直不動狀態(tài)(Freezing)，僵直時間百分比越高，表示越焦慮。1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS20．0軟件進行t檢驗、重復(fù)測量方差分析。2結(jié)果2.1sgＲNA和Cas9體外轉(zhuǎn)錄結(jié)果根據(jù)α7nAChＲ基因intron3和intron4靶序列信息設(shè)計sgＲNA，結(jié)果顯示，體外轉(zhuǎn)錄sgＲNA和Cas9成功，電泳圖見圖2。圖2體外轉(zhuǎn)錄sgＲNA和Cas9電泳結(jié)果2.2F0代小鼠基因型鑒定及擴群繁育陽性F0代小鼠α7nAChＲ基因在第四exon有531bp片段敲除，見圖3。選取陽性F0代小鼠與WTC57BL/6J小鼠回交，獲得穩(wěn)定遺傳的F1代雜合子，F(xiàn)1自交獲得F2代小鼠的PCＲ產(chǎn)物進行基因型鑒定，PCＲ鑒定電泳圖見圖4。根據(jù)結(jié)果選取α7nAChＲKO純合子進行擴繁。2.3行為學(xué)測試結(jié)果2.3.1曠場試驗KO組與WT組運動距離、運動速度、中心區(qū)域活動時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。圖3F0代陽性小鼠基因序列突變陳曉娟等應(yīng)用CＲISPＲ/Cas9技術(shù)制備阿爾茨海默病小鼠模型第11期·3472·
1:純合子;2:純合子;3:雜合子;4:雜合子;5:野生型;6:野生型;7:DNAmarker圖4F2小鼠基因鑒定電泳表1曠場實驗測試結(jié)果(x±s)組別n運動距離(cm)運動速度(cm/s)中心區(qū)域活動時間(s)WT組126861．1±472．387．62±0．5399．95±7．15KO組136684．37±276．097．42±0．3193．48±8．142.3.2高架十字迷宮試驗KO小鼠進入開臂的時間〔(45.24±6.63)s〕少于WT小鼠〔(53.63±7.94)s〕，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。2.3.3水迷宮試驗KO組與WT組在定向航行實驗和空間探索實驗無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，見表2。表2水迷宮測試結(jié)果(x±s，s)組別n定向航行試驗第1天第2天第3天第4天第5天空間探索實驗WT組1247．21±2．3127．26±3．5424．84±3．0517．98±2．4816．08±1．8830．64±2．12KO組1349．13±1．9332．03±2．5827．36±2．0719．28±2．4916．24±1．7029．73±1．732.3.4條件性恐懼反射系統(tǒng)試驗KO組僵直時間百分比高于WT組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。表3條件性恐懼記憶測試結(jié)果(x±s，%)組別n場景恐懼記憶水平聲音恐懼記憶水平WT組1231．29±3．0650．78±6．20KO組1337．88±5．0560．03±6．033討論AD主要病理特征是神經(jīng)元外周β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積引發(fā)的炎性斑點〔10〕。研究證實，AD患者膽堿能神經(jīng)元明顯減少，且α7nAChＲ在大腦皮質(zhì)和海馬部位顯著下降。Aβ拮抗α7nAChＲ引起的細(xì)胞毒性可以用α7nAChＲ激動劑緩解〔11〕。臨床試驗證明，α7nAC
【參考文獻】：
期刊論文
[1]Effects of medicinal plants on Alzheimer’s disease and memory deficits[J]. Muhammad Akram,Allah Nawaz. Neural Regeneration Research. 2017(04)
[2]阿爾茨海默病患者家庭照料者生活質(zhì)量及其影響因素[J]. 胡舒,譚小林,趙科,文宴,黃杰,陳非,蔣平靜,蔣振虹. 中國老年學(xué)雜志. 2017(07)
[3]帕金森病小鼠模型行為學(xué)檢測方法的比較研究[J]. 姚慶和,張華,高國棟. 中國實驗動物學(xué)報. 2006(04)
[4]BALB/c和C57BL/6小鼠在基因功能檢測中行為學(xué)的比較研究[J]. 金玫蕾,劉留,郭寧,莫韞,謝青蓮,李葆明,趙國屏,景乃禾. 中國實驗動物學(xué)報. 2001(01)
本文編號：3489540
【文章來源】：中國老年學(xué)雜志. 2019,39(11)北大核心
【文章頁數(shù)】：4 頁
【部分圖文】：
sgＲNA序列設(shè)計示意圖
潭仍降?。水迷宮試驗包括定向航行實驗及空間探索實驗。條件性恐懼反射系統(tǒng)是基于巴普洛夫條件反射而建立的一種經(jīng)典的誘導(dǎo)焦慮反應(yīng)模型的方法。動物在恐懼時會表現(xiàn)出特有的僵直不動狀態(tài)(Freezing)，僵直時間百分比越高，表示越焦慮。1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS20．0軟件進行t檢驗、重復(fù)測量方差分析。2結(jié)果2.1sgＲNA和Cas9體外轉(zhuǎn)錄結(jié)果根據(jù)α7nAChＲ基因intron3和intron4靶序列信息設(shè)計sgＲNA，結(jié)果顯示，體外轉(zhuǎn)錄sgＲNA和Cas9成功，電泳圖見圖2。圖2體外轉(zhuǎn)錄sgＲNA和Cas9電泳結(jié)果2.2F0代小鼠基因型鑒定及擴群繁育陽性F0代小鼠α7nAChＲ基因在第四exon有531bp片段敲除，見圖3。選取陽性F0代小鼠與WTC57BL/6J小鼠回交，獲得穩(wěn)定遺傳的F1代雜合子，F(xiàn)1自交獲得F2代小鼠的PCＲ產(chǎn)物進行基因型鑒定，PCＲ鑒定電泳圖見圖4。根據(jù)結(jié)果選取α7nAChＲKO純合子進行擴繁。2.3行為學(xué)測試結(jié)果2.3.1曠場試驗KO組與WT組運動距離、運動速度、中心區(qū)域活動時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。圖3F0代陽性小鼠基因序列突變陳曉娟等應(yīng)用CＲISPＲ/Cas9技術(shù)制備阿爾茨海默病小鼠模型第11期·3472·
1:純合子;2:純合子;3:雜合子;4:雜合子;5:野生型;6:野生型;7:DNAmarker圖4F2小鼠基因鑒定電泳表1曠場實驗測試結(jié)果(x±s)組別n運動距離(cm)運動速度(cm/s)中心區(qū)域活動時間(s)WT組126861．1±472．387．62±0．5399．95±7．15KO組136684．37±276．097．42±0．3193．48±8．142.3.2高架十字迷宮試驗KO小鼠進入開臂的時間〔(45.24±6.63)s〕少于WT小鼠〔(53.63±7.94)s〕，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。2.3.3水迷宮試驗KO組與WT組在定向航行實驗和空間探索實驗無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，見表2。表2水迷宮測試結(jié)果(x±s，s)組別n定向航行試驗第1天第2天第3天第4天第5天空間探索實驗WT組1247．21±2．3127．26±3．5424．84±3．0517．98±2．4816．08±1．8830．64±2．12KO組1349．13±1．9332．03±2．5827．36±2．0719．28±2．4916．24±1．7029．73±1．732.3.4條件性恐懼反射系統(tǒng)試驗KO組僵直時間百分比高于WT組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。表3條件性恐懼記憶測試結(jié)果(x±s，%)組別n場景恐懼記憶水平聲音恐懼記憶水平WT組1231．29±3．0650．78±6．20KO組1337．88±5．0560．03±6．033討論AD主要病理特征是神經(jīng)元外周β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積引發(fā)的炎性斑點〔10〕。研究證實，AD患者膽堿能神經(jīng)元明顯減少，且α7nAChＲ在大腦皮質(zhì)和海馬部位顯著下降。Aβ拮抗α7nAChＲ引起的細(xì)胞毒性可以用α7nAChＲ激動劑緩解〔11〕。臨床試驗證明，α7nAC
【參考文獻】：
期刊論文
[1]Effects of medicinal plants on Alzheimer’s disease and memory deficits[J]. Muhammad Akram,Allah Nawaz. Neural Regeneration Research. 2017(04)
[2]阿爾茨海默病患者家庭照料者生活質(zhì)量及其影響因素[J]. 胡舒,譚小林,趙科,文宴,黃杰,陳非,蔣平靜,蔣振虹. 中國老年學(xué)雜志. 2017(07)
[3]帕金森病小鼠模型行為學(xué)檢測方法的比較研究[J]. 姚慶和,張華,高國棟. 中國實驗動物學(xué)報. 2006(04)
[4]BALB/c和C57BL/6小鼠在基因功能檢測中行為學(xué)的比較研究[J]. 金玫蕾,劉留,郭寧,莫韞,謝青蓮,李葆明,趙國屏,景乃禾. 中國實驗動物學(xué)報. 2001(01)
本文編號：3489540
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