發(fā)布時(shí)間：2021-11-11 21:18

　　目的敲除α7煙堿型膽堿能受體（α7nAChR）基因構(gòu)建阿爾茨海默�。ˋD）小鼠模型,驗(yàn)證成年敲除（KO）鼠是否有AD表征。方法利用CRISPR/Cas9技術(shù),針對(duì)α7nAChR基因靶序列設(shè)計(jì)單鏈向?qū)NA（sgRNA）,將sgRNA和Cas9 mRNA顯微注射到C57BL/6J小鼠受精卵。通過檢測(cè)DNA序列,鑒定和篩選出KO小鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。結(jié)果 KO鼠α7nAChR基因有531 bp片段敲除;與野生型（WT）組相比,KO組有高架十字迷宮開壁區(qū)活動(dòng)時(shí)間短、條件性恐懼表現(xiàn)出僵直時(shí)間百分比增高的趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論成功制備AD模型鼠,成年KO鼠學(xué)習(xí)記憶功能正常,但有焦慮樣行為趨勢(shì)。 

【文章來源】：中國(guó)老年學(xué)雜志. 2019,39(11)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：4 頁(yè)

【部分圖文】：

sgＲNA序列設(shè)計(jì)示意圖

潭仍降?。水迷宮試驗(yàn)包括定向航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)。條件性恐懼反射系統(tǒng)是基于巴普洛夫條件反射而建立的一種經(jīng)典的誘導(dǎo)焦慮反應(yīng)模型的方法。動(dòng)物在恐懼時(shí)會(huì)表現(xiàn)出特有的僵直不動(dòng)狀態(tài)(Freezing)，僵直時(shí)間百分比越高，表示越焦慮。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20．0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、重復(fù)測(cè)量方差分析。2結(jié)果2.1sgＲNA和Cas9體外轉(zhuǎn)錄結(jié)果根據(jù)α7nAChＲ基因intron3和intron4靶序列信息設(shè)計(jì)sgＲNA，結(jié)果顯示，體外轉(zhuǎn)錄sgＲNA和Cas9成功，電泳圖見圖2。圖2體外轉(zhuǎn)錄sgＲNA和Cas9電泳結(jié)果2.2F0代小鼠基因型鑒定及擴(kuò)群繁育陽(yáng)性F0代小鼠α7nAChＲ基因在第四exon有531bp片段敲除，見圖3。選取陽(yáng)性F0代小鼠與WTC57BL/6J小鼠回交，獲得穩(wěn)定遺傳的F1代雜合子，F(xiàn)1自交獲得F2代小鼠的PCＲ產(chǎn)物進(jìn)行基因型鑒定，PCＲ鑒定電泳圖見圖4。根據(jù)結(jié)果選取α7nAChＲKO純合子進(jìn)行擴(kuò)繁。2.3行為學(xué)測(cè)試結(jié)果2.3.1曠場(chǎng)試驗(yàn)KO組與WT組運(yùn)動(dòng)距離、運(yùn)動(dòng)速度、中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。圖3F0代陽(yáng)性小鼠基因序列突變陳曉娟等應(yīng)用CＲISPＲ/Cas9技術(shù)制備阿爾茨海默病小鼠模型第11期·3472·

1:純合子;2:純合子;3:雜合子;4:雜合子;5:野生型;6:野生型;7:DNAmarker圖4F2小鼠基因鑒定電泳表1曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果(x±s)組別n運(yùn)動(dòng)距離(cm)運(yùn)動(dòng)速度(cm/s)中心區(qū)域活動(dòng)時(shí)間(s)WT組126861．1±472．387．62±0．5399．95±7．15KO組136684．37±276．097．42±0．3193．48±8．142.3.2高架十字迷宮試驗(yàn)KO小鼠進(jìn)入開臂的時(shí)間〔(45.24±6.63)s〕少于WT小鼠〔(53.63±7.94)s〕，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。2.3.3水迷宮試驗(yàn)KO組與WT組在定向航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，見表2。表2水迷宮測(cè)試結(jié)果(x±s，s)組別n定向航行試驗(yàn)第1天第2天第3天第4天第5天空間探索實(shí)驗(yàn)WT組1247．21±2．3127．26±3．5424．84±3．0517．98±2．4816．08±1．8830．64±2．12KO組1349．13±1．9332．03±2．5827．36±2．0719．28±2．4916．24±1．7029．73±1．732.3.4條件性恐懼反射系統(tǒng)試驗(yàn)KO組僵直時(shí)間百分比高于WT組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。表3條件性恐懼記憶測(cè)試結(jié)果(x±s，%)組別n場(chǎng)景恐懼記憶水平聲音恐懼記憶水平WT組1231．29±3．0650．78±6．20KO組1337．88±5．0560．03±6．033討論AD主要病理特征是神經(jīng)元外周β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積引發(fā)的炎性斑點(diǎn)〔10〕。研究證實(shí)，AD患者膽堿能神經(jīng)元明顯減少，且α7nAChＲ在大腦皮質(zhì)和海馬部位顯著下降。Aβ拮抗α7nAChＲ引起的細(xì)胞毒性可以用α7nAChＲ激動(dòng)劑緩解〔11〕。臨床試驗(yàn)證明，α7nAC

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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