目的利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚lkb1基因,觀察和驗證純合子表型,初步探討Lkb1對腎小管發(fā)育的影響。方法針對斑馬魚lkb1基因設(shè)計并體外合成gRNA,通過顯微注射技術(shù)將gRNA和Cas9 mRNA注入野生型胚胎一細(xì)胞期卵黃中,利用T7E1酶切和測序篩選出高效gRNA,通過測序篩選出F0代突變體及可遺傳突變體,野生魚和可遺傳突變體魚雜交產(chǎn)生F1代雜合子突變體,測序鑒定F1代雜合子突變類型,通過F1代雜合子自交產(chǎn)生F2代純合子幼魚,通過觀察鑒定出純合子表型;通過RT-PCR和免疫印跡驗證純合子表型;通過RT-PCR檢測腎小管標(biāo)志蛋白的mRNA水平。結(jié)果制備了斑馬魚lkb1 gRNA和Cas9 mRNA,篩選出三種產(chǎn)生移碼突變的雜合子,發(fā)現(xiàn)斑馬魚lkb1基因敲除純合子幼魚受精后第5天游動時頭尾劇烈擺動,異常興奮,魚鰾缺失,體軸彎曲,卵黃消耗過快,肝臟暗淡,腸道水腫,第8天大多數(shù)死亡;純合子g6pase,pdk2b,pcpck1mRNA顯著升高,Lkb1完全不表達(dá);腎小管標(biāo)志蛋白mRNA顯著升高。結(jié)論利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚lkb1基因,產(chǎn)生了肝臟衰竭,腸道水腫... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
英漢縮略詞名詞對照
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建斑馬魚lkb1敲除模型
    1 材料
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 結(jié)論
第二部分 斑馬魚lkb1突變體鑒定及表型分析
    1 材料
    2 方法
    3 結(jié)果
    4 討論
參考文獻(xiàn)
全文總結(jié)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9技術(shù)敲除faf1基因?qū)Π唏R魚軟骨及肌節(jié)發(fā)育的影響[J]. 劉菁,梁森,袁志,黃慧哲.  第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報. 2017(17)
[2]Attenuated LKB1-SIK1 signaling promotes epithelial-mesenchymal transition and radioresistance of non–small cell lung cancer cells[J]. Yuan-Hu Yao,Yan Cui,Xiang-Nan Qiu,Long-Zhen Zhang,Wei Zhang,Hao Li,Jin-Ming Yu.  Chinese Journal of Cancer. 2016(10)



本文編號：3476730