發(fā)布時(shí)間：2021-10-22 01:50

　　目的:高效表達(dá)人中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）重組蛋白并制備其多克隆及單克隆抗體。方法:人工合成經(jīng)密碼子優(yōu)化的NGAL基因,構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pW28-NGAL,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后分離純化并分析在溶液中的聚集狀態(tài);獲得的rhNGAL抗原免疫兔子制備多克隆抗體,免疫小鼠篩選高效價(jià)的特異性單克隆抗體并鑒定抗體亞型;Protein G親合柱純化,等溫滴定量熱法及非競爭ELISA法檢測抗體的親和力,SDS-PAGE分析純度;最后運(yùn)用Western blot、免疫熒光和免疫組化對抗體進(jìn)行鑒定。結(jié)果:高效獲得高純度NGAL重組蛋白,主要以單體形式存在;成功制備兔多抗,同時(shí)篩選獲得6株高效價(jià)單克隆抗體;其中,25號(hào)單抗為IgG1亞型,余者均屬IgG2a亞型,且19、35號(hào)單抗的親和常數(shù)分別為3.06×10⁹、2.14×10⁹。SDS-PAGE分析表明純度均大于90%。進(jìn)一步的鑒定結(jié)果表明制備的抗體皆具有良好免疫反應(yīng)性及特異性,且單抗的特異性明顯高于多抗。結(jié)... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2019,44(05)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

密碼子優(yōu)化后設(shè)計(jì)的NGAL基因序列

NGAL純化結(jié)果

重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2019年第44卷第5期(JournalofChongqingMedicalUniversity2019.Vol.44No.5)圖5抗NGAL抗體免疫熒光結(jié)果（400×）2.2NGAL的聚集狀態(tài)用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)對HiloadSuperdex75凝膠層析柱進(jìn)行定標(biāo)，根據(jù)洗脫曲線將洗脫體積和蛋白相應(yīng)分子量進(jìn)行擬合可得：LogMW=-0.01712×Ve+6.01667。同等條件下，過NGAL蛋白樣品，其洗脫體積約為96.6mL（圖3）。結(jié)合公式算得其在溶液中分子量約為23kD，提示NGAL在PBS溶液（10mmol/LPBS，pH7.4）中主要以單體形式存在。與人體內(nèi)天然存在的NGAL蛋白聚集形式一致[10]。2.3抗人NGAL抗體的制備本研究以純化的rhNGAL包板，對挑選的單克隆行2次間接ELISA篩選，得到14株高效價(jià)陽性雜交瘤細(xì)胞株。使用抗體分型檢測試劑對細(xì)胞上清進(jìn)行亞類鑒定，最后得到6株雜交瘤細(xì)胞株并大量培養(yǎng)及凍存，其中25號(hào)為IgG1亞型，8、11、19、23、35號(hào)為IgG2a亞型。上清抗體效價(jià)最高的2株細(xì)胞經(jīng)小鼠腹腔誘生法制腹水，產(chǎn)物用ProteinG柱純化，得到單抗19、單抗35。以樣品孔OD值與陰性對照孔OD值之比大于2.1為判斷標(biāo)準(zhǔn)，測得多抗1、多抗2、單抗19、單抗35純化前后的效價(jià)，見表1；BCA法測得純化后的4只抗體濃度分別為2.11、1.98、2.6和2.03mg/mL；經(jīng)SDS-PAGE電泳分析（圖4），抗體的純度皆超過90%，可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求；等溫滴定量熱法（isothermaltitrationcalorimetry，ITC）測得NGAL單克隆抗體19、35的親和常數(shù)分別為3.06×109、2.14×109，非競爭ELISA結(jié)果為2.62×109、1.72×109，兩者基本一致。2.4抗人NG

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]急性腎損傷的檢測指標(biāo)NGAL的研究進(jìn)展[J]. 馬玉國,趙紅麗,任秀華,趙俊月,馬玉國.  國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志. 2013(14)
[2]抗人NGAL單克隆抗體的制備及其定量檢測方法的建立[J]. 何瑩,鄭怡麟,陳安,易維京,胡川閩.  免疫學(xué)雜志. 2013(01)



本文編號(hào)：3450145