目的：表達SARS冠狀病毒核殼蛋白，研究建立SARS冠狀病毒感染血清學(xué)的診斷方法。 方法：構(gòu)建攜帶SARS冠狀病毒核殼抗原融合蛋白質(zhì)粒，將表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，原核表達His-N融合蛋白，鑒定其免疫原性，利用純化的重組SARS冠狀病毒N蛋白包被微孔板，建立間接ELISA法定性檢測人血清中抗SARS冠狀病毒IgG抗體的檢測方法，進行質(zhì)量控制，并利用該方法，檢測、觀察404份SARS患者血清中抗體產(chǎn)生和變化規(guī)律。 結(jié)果：獲得攜帶SARS冠狀病毒核殼抗原基因的pQE-30／N質(zhì)粒，通過大腸桿菌M15表達體系，在IPTG誘導(dǎo)條件下，可穩(wěn)定表達融合蛋白His-N。蛋白純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳，證實經(jīng)過純化融合蛋白的純度達到90％以上，Western blot結(jié)果顯示：可與確診的SARS病人的血清特異性結(jié)合。以抗原包被濃度0.10μg/孔包被16h，選擇1∶4000為酶結(jié)合物工作濃度，建立檢測血清N蛋白IgG抗體的間接ELISA法。檢測正常獻血員548份血清標本，確定臨界值。將該檢測方法與參比試劑進行比較，檢測臨床確診和血清學(xué)確證86例病人血清標本，對發(fā)病15天以上樣本檢測結(jié)果符合... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

表達載體的鑒定

圖2攜帶SARS冠狀病毒核殼(N)抗原基因表達載體圖譜N蛋白基因定向克隆于Ba耐I和KPnl位點攜帶SARS冠狀病毒核殼(N)抗原基因表達載體圖譜見圖2。N蛋白基因定向克隆于BamH工和KPn工位點，從pQE一30/N表達質(zhì)粒127bp到144bp處，為六組氨酸(6XHIS)的序列，轉(zhuǎn)錄翻譯融合蛋白;從151bp至1413bp，為N蛋白基因的序列。三、工程菌鑒定(一)PCR鑒定擴增產(chǎn)物得到1263bp基因片斷，確定為工程菌含有N蛋白基因。(二)限制性內(nèi)切酶鑒定培養(yǎng)工程菌，抽提質(zhì)粒，用BamH工和KPn工酶切，得到基因片斷為3450bp和127Obp

用免疫印跡方法鑒定N蛋白的免疫原性，用確診的SARS病人血清進行檢測，在相對分子質(zhì)量約為47000Da處可見一條單一的蛋白質(zhì)免疫結(jié)合帶，結(jié)果見圖3;用正常人血清進行檢測，無蛋白質(zhì)免疫結(jié)合帶出現(xiàn)，結(jié)果見圖4。圖3、SARS病人血清與N重組蛋白反應(yīng)的免疫印跡結(jié)果


本文編號：3400172