目的:建立高效的EV71病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng),快速獲得拯救病毒并鑒定其活性。方法:首先構(gòu)建含有人RNA聚合酶Ⅰ啟動(dòng)子（PpolⅠ）、ccdB自殺基因和鼠終止子（mTer）的接收質(zhì)粒pHM-ccdB,并在ccdB兩側(cè)引入AarⅠ酶切位點(diǎn);為了回避EV71病毒基因組中自身的AarⅠ酶切位點(diǎn),分兩段PCR擴(kuò)增基因組,在引物中引入必需的AarⅠ酶切位點(diǎn),通過(guò)Golden Gate Clone技術(shù)連接到目的載體中獲得病毒拯救質(zhì)粒pHT-EV71,轉(zhuǎn)染至RD細(xì)胞后,獲得拯救的EV71病毒,并以RT-PCR、病毒滴度、Western blot以及電鏡檢測(cè)等方法鑒定拯救子代病毒。結(jié)果:通過(guò)引入ccdB致死基因和Golden Gate Clone成功構(gòu)建了EV71病毒的拯救質(zhì)粒（pHT-EV71）,并將其轉(zhuǎn)染至RD細(xì)胞后,觀察到明顯的致細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect,CPE）,將得到的拯救子代病毒,經(jīng)EV71 VP1的特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,觀察到長(zhǎng)約1 900 bp的特異性條帶;Western blot結(jié)果顯示,該病毒可與EV71 VP1特異抗體結(jié)合;透射電子顯微鏡（trans... 

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2019,44(11)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1主要試劑與質(zhì)粒
    1.2 菌種、細(xì)胞與EV71病毒
    1.3 引物與載體構(gòu)建
    1.4 從質(zhì)粒中拯救EV71病毒
    1.5 拯救病毒的鑒定
2 結(jié)果
    2.1 EV71病毒拯救質(zhì)粒的構(gòu)建
    2.2 病毒的拯救及鑒定
    2.3 病毒的毒力鑒定及比較
3 討論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Development and characterization of a clinical strain of Coxsackievirus A16 and an eGFP infectious clone[J]. Chenglin Deng,Xiaodan Li,Siqing Liu,Linlin Xu,Hanqing Ye,Cheng-Feng Qin,Bo Zhang.  Virologica Sinica. 2015(04)
[2]Viral kinetics of Enterovirus 71 in human habdomyosarcoma cells[J]. Hsiang-Fu Kung.  World Journal of Gastroenterology. 2011(36)



本文編號(hào)：3381076