桿狀病毒載體表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)很有應(yīng)用價(jià)值的外源基因表達(dá)系統(tǒng),利用該系統(tǒng)大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白,其中一種主要的限制因素就是傳代效應(yīng)的影響。表現(xiàn)為病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中復(fù)制多代后,由于缺損干擾顆粒的聚集導(dǎo)致病毒和/或目的蛋白產(chǎn)量的顯著下降。本實(shí)驗(yàn)研究了重組病毒Ac-hIL12在Sf9連續(xù)傳代過(guò)程中是否會(huì)導(dǎo)致外源基因本身的突變。 將表達(dá)人白細(xì)胞介素12（human interleukin-12,hIL-12）的重組桿狀病毒（Ac-hIL12）經(jīng)空斑純化后,在草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞中進(jìn)行連續(xù)無(wú)稀釋傳代到P₅₅代,收集被P₁₅、P₂₅、P₃₅、P₄₅、P₅₅代重組病毒感染的細(xì)胞,抽提胞內(nèi)病毒（ICV）DNA。根據(jù)重組病毒構(gòu)建的原理,在P35 cDNA和P40 cDNA的3′末段設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR,擴(kuò)增出了包括P35 cDNA、Polyhedrin啟動(dòng)子、P10啟動(dòng)子和P40 cDNA序列在內(nèi)的全長(zhǎng)約2.0kb片段,克隆至T Vector進(jìn)行序列測(cè)定后發(fā)現(xiàn),在第P

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

P35cDNA突變區(qū)域的序列分析

IRES，p35不Ilp40a的pCR擴(kuò)增一3ThePCRamPlieationofP4O.IRES、P35andPationofP40，IRES，P35nadP40aresPeetively.or克隆R產(chǎn)物p35eDNA，p4oeDNA和IRES序腸桿菌后，隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行鑒定。首選，然后分別提取質(zhì)粒用各自引物上el)，pMD18/IRES(PSel、Ncol)，pMD18/p瓊脂糖電泳檢測(cè)酶切鑒定的結(jié)果(Fig.2一5)分泌膚。一faCtor的p4oaeDNA構(gòu)建

進(jìn)行膠回收后，克隆到pMD18T載體，并用Ncol和Notl進(jìn)行雙酶切鑒定(Fl.g2一5Lna3e)。并將酶切消化得到的克隆片段p400cDNA進(jìn)行回收純化，用于重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。圖2一spMDIS/p35、pMD18八RES和pMDIS/p4oQ的酶切鑒定Fig.2一5TheresrtietionnaalysisofthePMD18/P35，PMD18/IRESandPMD18/P40a

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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