目的制備抗CA16病毒的特異性單克隆抗體,評價單克隆抗體在ELISA和細胞免疫化學染色中的作用,并利用單抗建立CA16快速檢測膠體金免疫層析法并對其進行初步評價。方法 CA16病毒接種RD細胞大量培養(yǎng),氯化銫密度梯度超速離心純化病毒顆粒,透射電鏡鑒定純化產(chǎn)物。福爾馬林滅活病毒顆粒后免疫Balb/c小鼠,利用細胞融合技術制備穩(wěn)定分泌抗CA16單抗的雜交瘤細胞株。ELISA和免疫熒光試驗分別對單抗特性進行分析。根據(jù)單抗反應特性,分析單抗在細胞ELISA、細胞免疫組化中的應用,并利用特異性抗CA16單抗建立CA16膠體金免疫層析快速檢測法。結果氯化銫密度梯度離心純化病毒顆粒電鏡觀察顯示,病毒顆粒為二十面體立體對稱球形結構,大小均勻。經(jīng)免疫小鼠,獲得1株穩(wěn)定分泌抗CA16單克隆抗體的雜交瘤細胞株（mAb CA16-19）,該單抗為IgG2a亞型,細胞免疫熒光表明,單抗與RD宿主細胞內(nèi)的CA16病毒顆粒結合。細胞ELISA顯示,隨著病毒滴度增加吸光度也增加。細胞免疫化學染色分析表明,單抗可與CA16病毒感染的RD結合,而不與EV71感染RD細胞和正常RD細胞反應。因此,該單抗可用于細胞ELISA... 

【文章來源】：中國人獸共患病學報. 2019,35(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

圖１氯化銫密度梯度離心純化ＣＡ１６病毒顆粒Ｆｉｇ．１ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣＡ１６ｖｉｒｕｓｂｙｃｅｓｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ

圖２透射電鏡觀察純化的ＣＡ１６病毒顆粒（２５００００×）Ｆｉｇ．２ＰｈｏｔｏｇｒａｐｈｓｏｆＣＡ１６ｖｉｒａｌｐａｒｔｉｃｌｅｓａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（２５００００×）圖３ｍＡｂＣＡ１６－１９細胞免疫熒光試驗（４００×）Ｆｉｇ．３ＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｓｓａｙｏｆｍＡｂＣＡ１６－１９（４００×）內(nèi)有棕色著色，ｍＡｂＣＡ１６－１９不與ＥＶ７１感染ＲＤ細胞組和正常ＲＤ細胞組結合，免疫化學染色只有藍色細胞核著色（圖４）。２．５細胞ＥＬＩＳＡ細胞ＥＬＩＳＡ中，推測細胞內(nèi)源性過氧化物酶影響ＥＬＩＳＡ特異性檢測，因此，用不同濃度過氧化氫尿素處理細胞板。正常ＲＤ細胞組ＥＬＩＳＡ檢測顯示，不同濃度過氧化氫尿素處理組間吸光度值差異無統(tǒng)計學意義（Ｆ＝０．５８１，Ｐ＞０．０５）。ＣＡ１６感染ＲＤ細胞組ＥＬＩＳＡ檢測顯示，ＣＡ１６感染ＲＤ細胞后，不同濃度過氧化氫尿素處理組間吸光度值差異有統(tǒng)計學意義（Ｆ＝９．１５３，Ｐ＜０．０１），６０００ｍｇ／Ｌ組與０ｍｇ／Ｌ組間有統(tǒng)計學意義（ｔ＝－０．４２９，Ｐ＜０．０１），其他組與０ｍｇ／Ｌ組間比較均無統(tǒng)計學差異（Ｐ＞０．０５）。細胞ＥＬＩＳＡ表明，細胞內(nèi)源性過氧化物酶對細胞ＥＬＩＳＡ吸光度值影響較小，但當過氧化氫尿素濃度為６０００ｍｇ／Ｌ時，可降Ａ：ＣＡ１６感染ＲＤ細胞組；Ｂ：ＥＶ７１感染細胞組；Ｃ：正常ＲＤ

圖２透射電鏡觀察純化的ＣＡ１６病毒顆粒（２５００００×）Ｆｉｇ．２ＰｈｏｔｏｇｒａｐｈｓｏｆＣＡ１６ｖｉｒａｌｐａｒｔｉｃｌｅｓａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（２５００００×）圖３ｍＡｂＣＡ１６－１９細胞免疫熒光試驗（４００×）Ｆｉｇ．３ＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｓｓａｙｏｆｍＡｂＣＡ１６－１９（４００×）內(nèi)有棕色著色，ｍＡｂＣＡ１６－１９不與ＥＶ７１感染ＲＤ細胞組和正常ＲＤ細胞組結合，免疫化學染色只有藍色細胞核著色（圖４）。２．５細胞ＥＬＩＳＡ細胞ＥＬＩＳＡ中，推測細胞內(nèi)源性過氧化物酶影響ＥＬＩＳＡ特異性檢測，因此，用不同濃度過氧化氫尿素處理細胞板。正常ＲＤ細胞組ＥＬＩＳＡ檢測顯示，不同濃度過氧化氫尿素處理組間吸光度值差異無統(tǒng)計學意義（Ｆ＝０．５８１，Ｐ＞０．０５）。ＣＡ１６感染ＲＤ細胞組ＥＬＩＳＡ檢測顯示，ＣＡ１６感染ＲＤ細胞后，不同濃度過氧化氫尿素處理組間吸光度值差異有統(tǒng)計學意義（Ｆ＝９．１５３，Ｐ＜０．０１），６０００ｍｇ／Ｌ組與０ｍｇ／Ｌ組間有統(tǒng)計學意義（ｔ＝－０．４２９，Ｐ＜０．０１），其他組與０ｍｇ／Ｌ組間比較均無統(tǒng)計學差異（Ｐ＞０．０５）。細胞ＥＬＩＳＡ表明，細胞內(nèi)源性過氧化物酶對細胞ＥＬＩＳＡ吸光度值影響較小，但當過氧化氫尿素濃度為６０００ｍｇ／Ｌ時，可降Ａ：ＣＡ１６感染ＲＤ細胞組；Ｂ：ＥＶ７１感染細胞組；Ｃ：正常ＲＤ

【參考文獻】：
期刊論文
[1]柯薩奇病毒A16型快速純化和中和性單克隆抗體制備與鑒定[J]. 劉楊,趙向絨,關璐媛,王鑫,郭春艷,封青,衛(wèi)晶晶,胡軍,余鵬博.  國際檢驗醫(yī)學雜志. 2015(14)



本文編號：3298789